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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.42.2022.tde-24112022-121703
Documento
Autor
Nome completo
Larissa Costa de Almeida
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2022
Orientador
Banca examinadora
Lotufo, Leticia Veras Costa (Presidente)
Emery, Flavio da Silva
Lopes, Luciana Biagini
Rocha, Clarissa Ribeiro Reily
Título em português
Estudo da interação molecular da pradimicina-IRD com o DNA e seu mecanismo de ação em células tumorais.
Palavras-chave em português
Câncer
Dano em DNA
Pradimicina-IRD
Reparo de DNA
Resumo em português
As pradimicinas são substâncias citotóxicas produzidas por microrganismos. Em um trabalho prévio do nosso grupo, descrevemos uma nova pradimicina denominada pradimicina-IRD, com atividade em células tumorais, e certa seletividade para células de câncer de cólon. Dessa maneira, o objetivo deste trabalho foi investigar o mecanismo desse produto natural em um painel de células de cólon. Os resultados iniciais mostraram a pradimicina-IRD como um agente indutor de dano em DNA. Análises celulares e moleculares indicaram que a pradimicina-IRD induz dano ao DNA (fosforilação da proteína H2AX e indução da expressão de p21) independente da expressão de p53, parada do ciclo celular e apoptose (aumento da expressão de caspase-3 clivada e PARP1) em células de carcinoma colorretal. Apesar de sua estrutura molecular semelhante às antraciclinas, incluindo a doxorrubicina, a pradimicina-IRD difere da doxorrubicina em termos de potência, indução de p21, parada do ciclo celular e resposta independente de TP53. A partir desses resultados, passamos a investigar a interação molecular da pradimicina-IRD com o DNA e as vias de reparo de DNA relacionadas à resposta ao dano em DNA promovida por essa substância. Foram realizados ensaios celulares e moleculares, como docking molecular, transcriptômica de genes de reparo de DNA (PCR array), PCR, Western blot, MTT e ensaio clonogênico. Esses resultados mostram a pradimicina-IRD como um agente intercalante de DNA e um potencial inibidor de proteínas DNA ligantes. A análise transcriptômica revelou funções de reparo de DNA relacionadas a genes modulados por pradimicina-IRD, como reparo de excisão de nucleotídeos, manutenção de telômeros e reparo de quebra de fita dupla. A validação de genes relacionados a essas funções destacou o gene PCNA por apresentar interação DNApradimicina- PCNA (docking molecular) e redução de seus níveis proteicos em tratamentos com pradimicina-IRD. Além disso, hTERT e POLH mostraram níveis reduzidos de mRNA após 6 horas de tratamento com pradimicina-IRD. As células deficientes em POLH apresentaram maior resistência à pradimicina-IRD do que às células proficientes em POLH e essa substância impediu a formação do complexo POLH/DNA (docking molecular). Uma vez que a modulação dos genes de reparo de DNA pela pradimicina-IRD é independente de TP53, ao contrário da doxorrubicina, as diferenças entre o mecanismo de ação e a resposta ao dano em DNA entre a doxorrubicina e a pradimicina-IRD abrem uma nova perspectiva para estudos da pradimicina-IRD como um novo composto antineoplásico.
Título em inglês
Study of pradimicin-IRD molecular interaction with DNA and its tumor cell mechanism of action.
Palavras-chave em inglês
Cancer
DNA damage
DNA repair
Pradimicin-IRD
Resumo em inglês
Pradimicins are cytotoxic substances produced by microorganisms. In a previous work by our group, we described a new pradimicin called pradimicin-IRD, with activity in tumor cells, and certain selectivity for colon cancer cells. Thus, the aim of this work was to investigate the mechanism of this natural substance in a panel of colon cells. The initial results have shown pradimicin-IRD as a DNA-damaging agent against colon cancer cells. Cellular and molecular analyzes indicate that pradimicin-IRD induces DNA damage (phosphorylation of H2AX protein and induction of p21 expression) independent of p53 expression, cell cycle arrest, and apoptosis (increased cleaved caspase-3 and PARP1 expression) in colorectal carcinoma cells. Despite a similar molecular structure to anthracyclines, including doxorubicin, anticancer activity of pradimicin-IRD differs from that of doxorubicin in terms of potency, p21 induction, cell cycle arrest, and TP53 independent response. Based on these results, we further investigated the molecular interaction of pradimicin-IRD with DNA and the DNA repair pathways related to the DNA damage response promoted by this molecule. Cellular and molecular assays, such as molecular docking, transcriptomic of DNA repair genes (PCR array), PCR, Western blot, MTT, and clonogenic assay were carried out. Our results show pradimicin-IRD as a DNA intercalating agent and a potential inhibitor of DNA-binding proteins. Transcriptomic analysis revealed DNA repair functions related to pradimicin-IRD modulated genes, such as nucleotide excision repair, telomere maintenance and double-strand break repair. Validation of genes related to these functions highlighted the PCNA gene for presenting DNA-pradimicin-PCNA (molecular docking) interaction and reduction of their protein levels in pradimicin-IRD treatments. In addition, hTERT and POLH showed reduced mRNA levels after 6 hours of pradimicin-IRD treatment. Moreover, POLH-deficient cells displayed higher resistance to pradimicin-IRD than POLH-proficient cells and the compound prevented formation of the POLH/DNA complex (molecular docking). Since the modulation of DNA repair genes by pradimicin-IRD is TP53- independent, unlike doxorubicin, dissimilarities between mechanism of action and DNA damage response of doxorubicin and pradimicin-IRD open new insights for further studies of pradimicin-IRD as a new antineoplastic agent.
 
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Data de Liberação
2024-11-23
Data de Publicação
2022-12-09
 
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