Vários estudos têm demonstrado que a Crotoxina (CTX), principal toxina do veneno da serpente Crotalus durissus terrificus, possui ações antitumoral, anti-inflamatória, antiviral e imunomoduladora em modelos in vivo e in vitro. Em macrófagos, atividades biológicas, como crescimento, diferenciação, ativação, reconhecimento, endocitose, migração e secreção são processos relacionados à sinalização mediada por receptores expressos na superfície da membrana dessas células. Em relação às atividades imunomoduladoras, a CTX estimula, em particular, o metabolismo energético dos macrófagos e a produção de citocinas e Lipoxina A4 (LXA4) e seu análogo estável 15-Epi-LXA4 (15-Epi-LXA4), mediadores lipídicos com potente efeito imunomodulador. Sobre diferentes processos fisiopatológicos, estas ações da CTX são bloqueadas em sua totalidade por Boc-2, um antagonista do receptor peptídeo formil peptídeo (FPR). Além dos FPRs, essas atividades biológicas também envolvem processos como abertura e fechamento de canais iônicos, geração de curvatura de membrana e formação de poros. Apesar dessas evidências, ainda não se sabe se os FPRs estariam envolvidos e se também participam da entrada da toxina nos macrófagos, e ainda, de que forma esta toxina interage com diferentes moléculas da membrana. No presente estudo, foi investigado se o silenciamento dos FPRs 1 e 2 nos monócitos THP-1 ou macrófagos THP-1 poderia comprometer a entrada da CTX, por meio da técnica de nucleofecção para o silenciamento e imunofluorecências para observação da entrada da toxina nas células utilizando ou não inibidores como Boc-2 (FPRs 1 e 2). Foram realizados ensaios para avaliar atividade biológica como dosagem de peróxido, espraiamento, fagocitose e técnica de western blotting. Em ensaios termo-estruturais, foram utilizados lipídio neutro, como DPPC e aniônicos, como DPPG e DPPS que são mais abundantes na membrana celular dos macrófagos e técnicas como DSC, EPR e vazamento de carboxifluoresceína. Dos resultados, tanto a técnica de silenciamento de siRNA de FPR-1, bem como o ensaio farmacológico, usando Boc-2 (FPRs 1 e 2) demonstrou claramente a participação crucial de FPRs 1 e 2 e sua interação com a cascata de sinalização a jusante para tirosina quinase em ações imunomoduladoras da CTX sobre as funções de macrófagos humanos. Por outro lado, os FPRs não estão envolvidos com a entrada na toxina em macrófagos humanos, sugerindo que esses receptores são fundamentais para acionar as ações parácrinas e autócrinas de LXA4 e seu análogo 15-Epi-LXA4 induzidas por CTX em macrófagos. Foi demonstrado também que CTX pode além de penetrar nas células THP-1, induzir poros apenas nas membranas lipídicas aniônicas, em especial vesículas compostas por DPPS. Considerando que a seletividade da composição lipídica varia em diferentes tecidos e órgãos do corpo humano, os estudos termoestruturais aqui apresentados são extremamente importantes para abrir novas investigações sobre as atividades biológicas descritas para CTX em diferentes sistemas biológicos reais.

Several studies have shown that Crotoxin (CTX), the main toxin in the Crotalus durissus terrificus snake venom, has antitumor, anti-inflammatory, antiviral and immunomodulatory actions in in vivo and in vitro models. In macrophages, biological activities such as growth, differentiation, activation, recognition, endocytosis, migration and secretion are processes related to signaling mediated by receptors expressed on the membrane surface of these cells. Regarding immunomodulatory activities, CTX stimulates, in particular, the energy metabolism of macrophages and the production of cytokines and Lipoxin A4 (LXA4) and its stable analogue 15-Epi-LXA4 (15-Epi-LXA4), lipid mediators with potent immunomodulatory effect. On different pathophysiological processes, these actions of CTX are blocked in their entirety by Boc-2, a formyl peptide receptor (FPR) antagonist. In addition to FPRs, these biological activities also involve processes such as opening and closing ion channels, generating membrane curvature and pore formation. Despite this evidence, it is still unknown whether FPRs would be involved and if they also participate in the entry of the toxin into macrophages, and also how this toxin interacts with different molecules of the membrane. In the present study, it was investigated whether the silencing of FPRs 1 and 2 in THP-1 monocytes or THP-1 macrophages could compromise the entry of CTX, through the nucleofection technique for silencing and immunofluorescence to observe the entry of the toxin into cells using or not inhibitors such as Boc-2 (FPRs 1 and 2). Assays were carried out to evaluate biological activity such as peroxide dosage, spreading, phagocytosis and western blotting technique. In thermostructural assays, neutral lipids, such as DPPC and anionics, such as DPPG and DPPS, which are more abundant in the cell membrane of macrophages, and techniques such as DSC, EPR and carboxyfluorescein leakage, were used. From the results, both the FPR-1 siRNA silencing technique as well as the pharmacological assay using Boc-2 (FPRs 1 and 2) clearly demonstrated the crucial participation of FPRs 1 and 2 and their interaction with the a signaling cascade, for tyrosine kinase in CTX immunomodulatory actions on human macrophage functions. On the other hand, FPRs are not involved with toxin entry into human macrophages, suggesting that these receptors are critical to trigger the CTX-induced paracrine and autocrine actions of LXA4 and its 15-Epi-LXA4 analogue in macrophages. It was also demonstrated that CTX can, in addition to penetrating THP-1 cells, induce pores only in anionic lipid membranes, especially vesicles composed of DPPS. Considering that the selectivity of the lipid composition varies in different tissues and organs of the human body, the thermostructural studies presented here are extremely important to open new investigations on the biological activities described for CTX in different real biological systems.