A importância do sulfeto de hidrogênio (H₂S) na fisiopatologia é cada vez mais explorada, incluindo os efeitos benéficos de doadores de H₂S no sistema cardiovascular e na inflamação. Novos compostos com especificidade mitocondrial, como o AP39, fornecem H₂S diretamente nas mitocôndrias, embora seus mecanismos de ação ainda sejam desconhecidos. O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos e descrever os mecanismos de ação de dois tipos de doadores de H₂S, o doador espontâneo hidrossulfeto de sódio (NaHS) e mitocondrial AP39, na reatividade vascular de artérias mesentéricas de camundongos. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais do ICB/USP (CEUA 7759060218). Camundongos C57BL/6 anestesiados foram eutanasiados e seus leitos mesentéricos dissecados, para a dissecção de artérias mesentéricas de primeira ordem. Montou-se anéis destas artérias em miógrafo de arame para registro de tensão isométrica. As atividades vasculares dos compostos AP39, ADT-OH (porção doadora de H₂S do AP39) e NaHS foram avaliadas sobre o tônus basal e sob pré-contração com fenilefrina (1,7mM). Ainda, as respostas ao AP39 e NaHS foram avaliadas após inibição farmacológica das enzimas ciclo-oxigenases (com indometacina), óxido nítrico sintases (com L-NAME), guanilato ciclase solúvel (com ODQ), fosfodiesterase V (com sildenafila), produtoras de H₂S (com AOAA), bloqueio inespecífico dos canais de potássio (com TEA), dos canais de potássio sensíveis a ATP (K_ATP; com glibenclamida) ou dos canais de potássio ativados por cálcio (com apamina). Valores de resposta máxima (E_max) e potência (pA₂; -log da concentração molar de agonista que causa 50% da resposta máxima) foram calculados a partir das curvas de concentração vs. resposta. A expressão gênica e proteica das enzimas produtoras de H₂S (CSE, CBS e 3MPST) foram analisadas por RT-PCR e Western blotting, respectivamente e a produção de H₂S pelos homogenatos das artérias pelo método colorimétrico baseado na formação de sulfeto de chumbo. Os experimentos de RT-PCR revelaram a expressão gênica das enzimas CSE e 3MPST, enquanto os experimentos de Western blotting evidenciaram a expressão proteica de todas as enzimas. A inibição não seletiva das enzimas produtoras de H₂S pelo AOAA aboliu a produção endógena de H₂S, ao passo que PAG (inibidor seletivo da CSE) ou o NPS (doador de NO), reduziram-na em cerca de 50%. O vasorelaxamento promovido por todos os doadores de H₂S testados mostraram-se dependentes da presença do endotélio e especificamente dependentes da sinalização do NO e abertura de canais de potássio. Entretanto, o H₂S endógeno mostrou-se participante do mecanismo de ação do AP39 e a inibição de K_ATP não atenuou o vasorelaxamento do AP39, contrastando ao NaHS. No presente estudo evidenciou-se o vasorelaxamento induzido pelos diferentes doadores de H₂S. Notou-se diferenças nos mecanismos de ação, provavelmente associadas às diferenças de mecanismos de liberação e localização do H₂S. Ainda, a maior potência na ordem de dez vezes do AP39 em comparação ao NaHS confere uma vantagem aos doadores mitocondriais de H₂S. Considerando os achados do presente estudo, bem como seus efeitos anteriormente descritos, os doadores mitocondriais de H₂S podem demonstrar uma boa perspectiva para o tratamento das doenças cardiovasculares.

The number of studies on the importance of the physiopathological effects of hydrogen sulfide (H₂S) is growing, including those describing the beneficial effects of H₂S-donors on the cardiovascular system and inflammation. Among the H₂Sdonors, newly developed mitochondria-targeted compounds, such as AP39, supply H₂S into the mitochondrial environment, however, their mechanisms of action are still unknown. The objective of the present study was, thus, to analyze the effects and describe the mechanisms of action of two types of H₂S-donors, the spontaneous H₂S-donor sodium hydrosulfide (NaHS) and the mitochondria targeted H₂S-donor AP39, on the vascular reactivity of mouse mesenteric artery. All the experimental procedures were approved by the Ethics Committee in Animal Use (CEUA 7759060218). Anesthetized C57BL/6 mice were euthanized and the mesenteric bed dissected for isolating of first-order mesenteric arteries. Mesenteric artery rings were mounted in a wire myograph for isometric tension recording. The vascular activity of AP39, ADT-OH (the H₂S-donor moiety of AP39) and NaHS were analyzed on resting vessels and under 1.7mM phenylephrineinduced pre-contraction. In addition, the H₂S-donor responses were assessed under pharmacological inhibition of cyclooxygenases (by indomethacin), nitric oxide synthases (by L-NAME), soluble guanylate cyclase (by ODQ), type Vphosphodiesterase (by sildenafil) and the H₂S-producing enzymes (by AOAA), non-selective inhibition of K⁺ channels (by TEA), selective inhibition of ATPsensitive K⁺ channels (by glibenclamide) or Ca²⁺-activated K⁺ channels (by apamin). Maximal response (E_max) and potency (pA₂; as -log of the agonist concentration necessary to achieve 50% of E_max) values were obtained from concentration-response curves. Protein and gene expressions of the H₂Sproducing enzymes (CBS, CSE and 3MPST) were analyzed by Western blot and RT-PCR, respectively. The in vitro production of H₂S by mesenteric artery homogenates was assessed by a colorimetric method based on the formation of lead sulfide. RT-PCR experiments evidenced the gene expression of CSE and 3MPST in the vessels, whereas the protein expression of all the 3 enzymes were demonstrated by the Western blotting experiments. Non-selective inhibition of H₂S-producing enzymes by AOAA abolished H₂S production, whereas it was partially inhibited by PAG (a CSE selective inhibitor) or SNP (a NO-donor). Vasorelaxation promoted by AP39, ADT-OH and NaHS were all endotheliumdependent and specifically dependent of NO signaling and K⁺ channels opening. However, endogenous H₂S participates in the mechanism of action of AP39, but not of NaHS. Moreover, K_ATP blockade did not attenuate AP39 vasorelaxation. In the present study it is demonstrated the vasorelaxant activities of different classes of H₂S-donors, and their differences are likely associated to the mechanisms of H₂S release as well as the sites where H₂S becomes available. Furthermore, the higher potency of AP39 in comparison with NaHS (approximately ten-fold) confers advantages to mitochondrial H₂S-donors. Considering the results of the present study and the previously demonstrated effects, mitochondria-targeted H₂S-donors may offer a good perspective in cardiovascular disease therapeutics.