A febre maculosa das Montanhas Rochosas, conhecida no Brasil como febre maculosa brasileira (FMB), é a riquetsiose mais grave que acomete o homem. A doença é causada por Rickettsia rickettsii, uma -proteobactéria intracelular obrigatória transmitida pela picada de diferentes espécies de carrapatos. Apesar das altas taxas de letalidade da FMB, sua profilaxia baseia-se exclusivamente na prática de se evitar o contato com os carrapatos vetores. Neste contexto, a identificação e caracterização das proteínas envolvidas nas interações entre R. rickettsii e carrapatos é importante, podendo auxiliar na identificação de potenciais alvos para o controle da doença. Para isso, o uso de um sistema in vitro (linhagem celular) é fundamental, pois permite que análises sejam realizadas ao longo da infecção e com um maior controle das condições experimentais que os experimentos in vivo, além de não envolver o uso de animais vertebrados. Assim, o objetivo geral desse projeto de pesquisa foi identificar o conjunto de proteínas (proteoma) de células do carrapato Rhipicephalus microplus (linhagem BME26) infectadas ou não por R. rickettsii. As proteínas extraídas de células BME26 em um ponto inicial da (6 h) e na fase exponencial de crescimento bacteriano (48 h) foram processadas e analisadas por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas in tandem (LC-MS/MS). Como controle, as proteínas extraídas de células não infectadas nos pontos de 6 e 48 h foram igualmente processadas e analisadas. Um total de 1.119 proteínas foram identificadas, das quais 1.111 correspondem a proteínas de carrapatos e apenas oito a proteínas de bactérias, as quais foram desconsideradas das análises subsequentes. Após 6 h de infecção, 163 proteínas de foram induzidas e 159 foram reprimidas. Em 48 h, 95 proteínas foram induzidas e 65 foram reprimidas. Dentre as proteínas moduladas em resposta à infecção por R. rickettsii, proteínas de regulação negativa de apoptose foram reprimidas no ponto de 6 h e induzidas no ponto de 48 h. A apoptose é um processo de morte celular programada, o qual é ativado por diferentes estímulos, inclusive por infecções. Após o reconhecimento do estímulo, uma série de fatores são ativados, incluindo as enzimas-chave do processo, denominadas caspases, culminando na morte celular. Como o sistema imune de artrópode é mais simples que o sistema imune de vertebrados, a apoptose é um mecanismo importante de controle das infecções. Dessa forma, avaliamos a fragmentação de DNA genômico (DNAg) e a exposição de fosfatidilserina na face externa da membrana plasmática, duas características típicas de células em apoptose, e a atividade de caspase 3 em células BME26 infectadas ou não por R. rickettsii. A fragmentação de DNAg foi observado apenas nas células não infectadas após 96 h. Além disso, a atividade da caspase-3 foi significativamente menor em células infectadas em relação ao controle. Em contrapartida, a inibição da atividade da caspase-3 não foi observada quando as células foram estimuladas com riquétsias termo-inativadas, sugerindo que fatores produzidos por R. rickettsii sejam necessários para esse efeito. A exposição de fosfadidilserina também foi pronunciadamente maior em células infectadas do que em células não infectadas ou estimuladas com bactérias termo-inativadas. A inibição química da apoptose com Z-DEVD-Fmk, inibidor de caspase-3, favoreceu o crescimento de R. rickettsii em células BME26. Por outro lado, o tratamento com estaurosporina, um ativador clássico da apoptose, inibiu o crescimento bacteriano. Em conjunto, os dados mostram que o processo de apoptose em células BME26 é controlado por R. rickettsii, o que é importante para a sua proliferação. Esse é o primeiro relato sobre a inibição da apoptose em células de carrapatos por bactérias do gênero Rickettsia. Estudos futuros deverão ser realizados para identificar as proteínas de R. rickettsii, bem como de seus carrapatos vetores, envolvidas no controle da apoptose, podendo auxiliar numa melhor compreensão da interação vetor-patógeno.

Rocky Mountain spotted fever, known in Brazil as Brazilian spotted fever (FMB), is the most severe rickettsial disease that affects humas. The disease is caused by Rickettsia rickettsii, an obligate intracellular -proteobacterium transmitted by the bite of different species of ticks. Despite the high rates of FMB lethality, its prophylaxis is based exclusively on the practice of avoiding contact with the vector ticks. In this context, the identification and characterization of the proteins involved in the interactions between R. rickettsii and ticks is important and may help to identify potential targets for disease control. To this end, the use of an in vitro system (cell line) is fundamental because it allows that analyzes can be carried out throughout the infection and with a greater control of the experimental conditions than the in vivo experiments, besides not involving the use of vertebrate animals. Thus, the general objective of this research project was to identify the protein (proteome) of Rhipicephalus microplus tick cells (BME26 line) infected or not by R. rickettsii. Proteins extracted from BME26 cells at a starting point of infection (6 h) and in the exponential phase of bacterial growth (48 h) were processed and analyzed by liquid chromatography coupled to in-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). As a control, proteins extracted from uninfected cells at 6 and 48 h were also processed and analyzed. A total of 1,119 proteins were identified, of which 1,111 corresponded to tick proteins and only eight to bacterial proteins, which were discarded from subsequent analyzes. After 6 h of infection, 163 proteins were upregulated and 159 were downregulated. In 48 h, 95 proteins were upregulated and 65 were downregulated. Among the proteins modulated in response to R. rickettsii infection, apoptosis negative regulatory proteins were downregulated at the 6 h point and upregulated at the 48 h point. Apoptosis is a programmed cell death process, which is activated by different stimuli, including infections. After the stimulus recognition, a number of factors are activated, including the key enzymes of process, called caspases, culminating in cell death. As the arthropod immune system is simpler than the vertebrate immune system, apoptosis is an important mechanism of infection control. Therefore, we evaluated the fragmentation of genomic DNA (DNAg) and the phosphatidylserine exposure on the outer surface of the plasma membrane, two typical characteristics of cells in apoptosis, as well as the activity of caspase 3, in BME26 cells infected or not by R. rickettsii. DNAg fragmentation was observed only in uninfected cells after 96 h. In addition, caspase-3 activity was significantly lower in infected cells than in control cells. In contrast, inhibition of the caspase-3 activity was not observed when cells were stimulated with heat-killed rickettsiae, suggesting that factors produced by R. rickettsii are required for such effect. Phosphedidylserine exposure was also markedly higher in infected cells than in uninfected or in cells stimulated with heat-killed bacteria. Chemical inhibition of apoptosis with Z-DEVD Fmk, a caspase-3 inhibitor, favored the growth of R. rickettsii in BME cells26. On the other hand, staurosporin treatment, a classic activator of apoptosis, inhibited bacterial growth. Taken together, these data show that the process of apoptosis in BME26 cells is controlled by R. rickettsii, which is important for its proliferation. This is the first report on the inhibition of apoptosis in tick cells by bacteria of the genus Rickettsia. Future studies should be carried out to identify the rickettsial proteins, as well as their vector ticks, involved in the control of apoptosis, and may help to better understand the vector-pathogen interaction.