Análise comparativa do proteoma de membrana de promastigotas das cepas PH8 e LV79 de Leishmania (Leishmania) amazonensis.

Tano, Fabia Tomie

doi:10.11606/D.42.2021.tde-18012024-184612

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Dissertação de Mestrado

DOI

https://doi.org/10.11606/D.42.2021.tde-18012024-184612

Documento

Dissertação de Mestrado

Autor

Tano, Fabia Tomie (Catálogo USP)

Nome completo

Fabia Tomie Tano

Unidade da USP

Instituto de Ciências Biomédicas

Área do Conhecimento

Biologia da Relação Patógeno-Hospedeiro

Data de Defesa

2021-02-26

Imprenta

São Paulo, 2021

Orientador

Carboni, Beatriz Simonsen Stolf (Catálogo USP)

Banca examinadora

Carboni, Beatriz Simonsen Stolf (Presidente)
Cruz, Angela Kaysel
Véliz, Mauro Javier Cortez
Veras, Patrícia Sampaio Tavares

Título em português

Análise comparativa do proteoma de membrana de promastigotas das cepas PH8 e LV79 de Leishmania (Leishmania) amazonensis.

Palavras-chave em português

Leishmania (Leishmania) amazonensis
Cepas
Proteínas de membrana
Proteoma

Resumo em português

Doenças humanas causadas por protozoários do gênero Leishmania são classificadas de acordo com suas manifestações clínicas em leishmaniose visceral e tegumentar. Recentemente, nosso grupo comparou as cepas PH8 e LV79 de Leishmania (Leishmania) amazonensis, um dos principais agentes etiológicos da leishmaniose tegumentar no Brasil. Parasitos da cepa PH8 causam lesões maiores e com maior carga parasitária em modelos murinos. Além disso, um maior número de promastigotas de PH8 adere e é internalizado por macrófagos murinos in vitro, indicando uma diferença na composição da membrana das cepas. Neste projeto mostramos que promastigotas de PH8 são mais resistentes à lise por complemento (soro) murino do que os de LV79. Tendo em mente as diferenças de infectividade e sensibilidade à lise descritas, este estudo teve como objetivo principal analisar a composição da membrana de promastigotas de fase estacionária inicial de PH8 e LV79, com o intuito de identificar moléculas potencialmente envolvidas nas diferenças de fenótipo observadas. Para tal, a caracterização bioquímica preliminar do lipofosfoglicano (LPG) e a análise comparativa do proteoma de membrana foram realizadas, e os resultados dessa última foram confirmados por Western blot e ensaios de atividade enzimática. A caracterização bioquímica preliminar indica que o LPG de PH8 possui um número menor de unidades repetitivas, que são desprovidas de cadeias laterais. Em contrapartida, o LPG de promastigotas de LV79 é formado por unidades repetitivas sem cadeia lateral ou com cadeias laterais compostas por mono- e dissacarídeos, confirmando a existência de polimorfismos entre cepas. A análise comparativa do proteoma de membrana indica que cada cepa possui um possui um perfil característico. Das 1659 proteínas identificadas, 127 são mais abundantes em promastigotas de PH8 e 78 mais abundantes em LV79. Dentre as proteínas mais abundantes em LV79, a maioria participa da síntese proteica (47%), do metabolismo de aminoácidos (21%) e do metabolismo de nucleotídeos (14%). Por outro lado, as proteínas mais abundantes em PH8 estão envolvidas principalmente no metabolismo de carboidratos (21%), na composição do citoesqueleto (17%) e no tráfego de vesículas e membrana (13%). Proteínas relacionadas à virulência como o transportador putativo ABC (ATP-binding cassette) da subfamília G, membro 1 e a enolase foram identificadas como mais abundantes em PH8, em contrapartida a glicoproteína 63 (GP63) foi identificada como mais abundante em LV79. As análises da abundância da GP63 e da enolase por Western blot confirmam o que foi observado na análise proteômica. Contudo, ensaios de atividade enzimática obtiveram resultados dissonantes, indicando que a atividade dessas proteínas pode ser regulada e não necessariamente corresponde a sua expressão. Ao todo, nossos resultados indicam que as composições da membrana de promastigotas de PH8 e LV79 diferem entre si. Experimentos adicionais precisam ser realizados para determinar as implicações dessas diferenças nos fenótipos das duas cepas.

Título em inglês

Comparative analysis of the membrane proteome of Leishmania (Leishmania) amazonensis promastigotes of PH8 and LV79 strains.

Palavras-chave em inglês

Leishmania (Leishmania) amazonenses
Membrane proteins
Proteome
Strains

Resumo em inglês

Human diseases caused by protozoa of the genus Leishmania are classified according to their clinical manifestations into visceral and cutaneous leishmaniasis. Recently, our group compared the PH8 and LV79 strains of Leishmania (Leishmania) amazonensis, one of the main etiologic agents of cutaneous leishmaniasis in Brazil. Parasites of the PH8 strain cause larger lesions with greater parasite load in murine models. In addition, a greater number of PH8 promastigotes adhere to and are internalized by murine macrophages in vitro, indicating a difference in the membrane composition between these strains. In this project, we show that promastigotes of PH8 are more resistant to lysis by murine complement (serum) than LV79. Bearing in mind the differences in infectivity and sensitivity to lysis described, this study aimed to analyze the membrane composition of PH8 and LV79 early stationary phase promastigotes in order to identify proteins potentially involved in the phenotypic differences observed. To accomplish this task, the preliminary biochemical characterization of the lipophosphoglycan (LPG) and the comparative analysis of the membrane proteome were performed, and the results of the latter were confirmed by Western blot and enzymatic activity assays. The preliminary biochemical characterization indicates that LPG from PH8 promastigotes has a smaller number of repetitive units, which are devoid of side chains. In contrast, LPG from LV79 promastigotes is composed by repetitive units without a side chain or with side chains composed of mono- and disaccharides, confirming the existence of polymorphisms between strains. The comparative analysis of the membrane proteome indicates that each strain has a characteristic profile. Of the 1659 proteins identified, 127 are more abundant in PH8 promastigotes and 78 more abundant in LV79. Among the proteins more abundant in LV79, most of them participate in processes such as protein synthesis (47%), amino acid metabolism (21%), and nucleotide metabolism (14%). On the other hand, the proteins more abundant in PH8 are involved in carbohydrate metabolism (21%), cytoskeleton composition (17%), and vesicle and membrane trafficking (13%). Virulence-related proteins such as the putative ABC (ATP-binding cassette) transporter subfamily G, member 1 and enolase were identified as more abundant in PH8, whereas glycoprotein 63 (GP63) was identified as more abundant in LV79. Analysis of the abundance of GP63 and enolase by Western blot confirmed what was observed in the proteomic analysis. However, enzymatic activity assays obtained dissonant results, indicating that the activity of these proteins can be regulated and does not necessarily correspond to their expression. Altogether, our results indicate that membrane composition of the PH8 and LV79 promastigotes differ from each other. Additional experiments must be carried out to determine the implications of these differences on the strains phenotypes.

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Data de Liberação
2026-01-17

Data de Publicação
2024-01-19

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