O agente etiológico da malária é o Plasmodium, protozoário do filo Apicomplexa, e a espécie P. falciparum é responsável pelo quadro clinicamente mais severo da doença no ser humano. Cerca de 90% dos casos de malária e das mortes em decorrência da doença são registrados no continente africano. O ciclo de vida do Plasmodium se alterna entre dois hospedeiros: (i) os mosquitos, nos quais ocorre a reprodução sexuada; (ii) e os vertebrados, nos quais o Plasmodium invade hepatócitos e eritrócitos, multiplicando-se assexuadamente. Os íons cálcio (Ca2+) possuem importante papel na secreção de micronemas, na mobilidade celular, na invasão e egressão da célula hospedeira e na diferenciação celular em Plasmodium. Nosso grupo já demonstrou que o Ca2+ é o segundo mensageiro da via sinalizadora ativada pela melatonina, o qual tem papel fundamental no desenvolvimento e sincronização dos parasitas durante a fase intraeritrocítica. O composto 2-APB é um bloqueador do receptor de IP3 e de storeoperated calcium entry (SOCE) em células de eucariotos superiores e inibidor do aumento de Ca2+ citosólico induzido por melatonina em Plasmodium. No presente trabalho, reportamos que, em alta concentração, dois análogos mais potentes de 2- APB, os compostos DBP162-AE e DPB163-AE, inibem completamente o aumento de Ca2+ citosólico induzido por melatonina e SOCE induzido por thapsigargina, bem como impedem o desenvolvimento intraeritrocítico de P. falciparum. Os resultados reportados neste projeto corroboram não só a hipótese de que a melatonina atua via PLC-IP3 para mobilizar estoques intracelulares de Ca2+ em P. falciparum, mas também a evidência da existência de SOCE induzido por thapsigargina em parasitas. O aparecimento de cepas resistentes aos antimaláricos mais utilizados no tratamento contra a malária demonstra a necessidade da utilização de novas técnicas e estratégias no combate à doença, como o screening em larga escala de compostos. Portanto, em outra etapa do projeto, realizamos a triagem de aproximadamente 13.176 compostos da biblioteca TCAM/GSK, a qual possui alvos hipotéticos de proteínas de membrana, como GPCRs e receptores serotonérgicos e adrenérgicos. Numa primeira etapa realizamos o tratamento da cepa noucaute PfSR25- com os compostos e selecionamosos que tiveram maior impacto no desenvolvimento intraeritrocítico de parasitas. Numa segunda etapa, comparamos o efeito do tratamento com os compostos selecionados em ambas cepas selvagem (Pf3D7) e nocaute. Os resultados da triagem abrem caminho para investigar os mecanismos de ação de potenciais antimaláricos. No estudo da dinâmica de Ca2+ no parasita da malária, os protocolos utilizados para o loading com os marcadores de cálcio são muito invasivos e não permitem a distinção entre o sinal da célula hospedeira e o parasita. Nesse sentido, a cepa PfGCaMP3 é uma ferramenta importante no estudo das oscilações espontâneas de Ca2+ intracelular em parasitas sem a necessidade da utilização de marcadores externos. Demonstramos ocorrer oscilações de Ca2+ espontâneas em anel, trofozoíto e esquizonte utilizando PfGCaMP3.

The etiological agent of malaria is Plasmodium, a protozoan from the phylum Apicomplexa. The species P. falciparum is responsible for the most severe clinical picture of the disease in humans. About 90% of malaria cases and deaths occur on the African continent. The life cycle of Plasmodium alternates between two hosts: (i) mosquitoes, in which sexual reproduction occurs; (ii) and vertebrates, in which Plasmodium invades hepatocytes and erythrocytes, multiplying asexually. Calcium ions (Ca2+) play an essential role in the secretion of micronemes, in cell mobility, in the host cell's invasion and egress, and in cell differentiation in Plasmodium. Our group has already demonstrated that Ca2+ is the second messenger of the signaling pathway activated by melatonin, which plays a fundamental role in developing and synchronizing parasites during the intra-erythrocytic phase. The 2-APB compound is an IP3 receptor and SOCE blocker in higher eukaryotic cells and an inhibitor of melatonin-induced cytosolic Ca2+ increase in Plasmodium. In the present work, we report that, in high concentration, two more potent 2-APB analogs, the compounds DBP162-AE and DPB163-AE, completely inhibit the cytosolic Ca2+ increase induced by melatonin and SOCE induced by thapsigargin, as well as prevent the intraerythrocytic development of P. falciparum. The results reported in this project corroborate the hypothesis that melatonin acts via PLC-IP3 to mobilize intracellular stocks of Ca2+ in P. falciparum and the evidence of the existence of SOCE induced by thapsigargin in parasites. The appearance of strains resistant to antimalarials most used in the treatment against malaria reflects the need to use new techniques and strategies to combat the disease, such as large-scale screening of compounds. Therefore, this thesis also describes the screening of 13,176 compounds from the TCAM/GSK library. They have hypothetical targets for membrane proteins, such as GPCRs and serotonergic and adrenergic receptors. In the first stage, we performed the treatment of the noucaute strain PfSR25- with the compounds and selected the ones that had the most significant impact on the intra-erythrocytic development of parasites. In a second step, we compared the treatment's effect with the selected compounds in both wild type (Pf3D7) and knockout strains. The results of the preliminary screening open the way to investigate the mechanisms of action of potential antimalarials. In the study of Ca2+ dynamics in the malaria parasite, the protocols used for loading with calcium markers are very invasive. They do not allow the distinction between the host cell signal and the parasite. In this sense, the PfGCaMP3 strain is an essential tool in studying spontaneous intracellular Ca2+ oscillations in parasites without the need to use external markers. We demonstrated spontaneous ring, trophozoite and schizont Ca2+ fluctuations using PfGCaMP3.