A tripanossomiase humana africana (HAT) e uma doenca transmitida pela mosca tsetse infectada com parasitas da especie Trypanosoma brucei. Embora na atualidade essa doenca seja considerada como um problema de saude publica, nao existe nem vacina nem uma droga recomendada disponivel para prevenir a HAT. Assim, o controle do vetor e o tratamento dos pacientes sao as unicas ferramentas disponiveis para combater esta doenca. O tratamento com drogas de primeira linha, para as fases aguda e cronica da doenca, incluem a quimioterapia com agentes que geram efeitos colaterais graves, como a suramina, pentamidina, melarsoprol e eflornitina. Recentemente, uma abordagem alternativa no tratamento da HAT inclui considerar o parasita T. brucei como uma celula tumoral do sangue, ja que este compartilha com as celulas cancerigenas do sangue algumas propriedades como: a natureza eucariotica, o nicho na corrente sanguinea e a alta taxa de proliferacao. Tais caracteristicas devem permitir modelar o tratamento da HAT mediante o uso de ferramentas que incluam o emprego rotineiro de inibidores dos mecanismos de controle do ciclo celular. Neste sentido, a compreensao dos mecanismos envolvidos no controle do ciclo celular do parasita pode contribuir de maneira significativa para o desenvolvimento de terapias anti-tripanossomas. Neste trabalho nos analisamos os mecanismos moleculares envolvidos no processo de checkpoint e reparo de DNA do T. brucei em resposta a quebras de dupla fita de DNA (DSBs). Apos tratamento com IR, o T. brucei ativa pontos de checkpoint para interromper o ciclo celular coordenados pelas quinases tripanosomais PI3KKs (Principalmente ATM e ATR). Essa resposta e dependente da fase do ciclo celular do parasita durante o dano. Apos DSBs, ATM mostrou ter um papel principal controlando a transicao G1-S e intra-S do ciclo celular, enquanto a ATR exibe funcoes essenciais no checkpoint intra-S, bem como na passagem dos parasitas nas fases G2-M apos dano e um papel discreto na passagem pela transicao G1-S. Tambem foi observado que durante as fases lateS/G2, após danos no DNA, o marcador de cromatina gH2A e fosforilado enquanto a maquinaria HR e sequencialmente recrutada para o DNA, desencadeando o reparo das DSBs via RAD51 em aproximadamente 6 h, sob a regulacao da quinase ATR. Nossos dados sugerem que esse mecanismo foi ausente nas fases G1/earlyS onde nos sugerimos um mecanismo independente das proteinas da via HR atuando no conserto das DSBs que leva mais de 6 h para ocorrer. Finalmente, nos mostramos que a pentamidina, droga de primeira linha usada no tratamento da HAT aguda, gera quebras de DNA e ativa uma via que fosforila o marcador de DSBs, gH2A. Usando inibidores das quinases ATM e/ou ATR nos observamos a sensibilizacao dos parasitas frente a droga evidenciada pela maior deteccao de DSB. Juntos, esses dados mostram que o conhecimento do ciclo celular em tripanossomas, bem como do modo de acao de drogas, pode levar ao desenvolvimento de terapias combinatorias que devem auxiliar no controle das doencas causadas por estes parasitas.

Human African Trypanosomiasis (HAT) is a disease transmitted by the tsetse fly infected with parasites of the species Trypanosoma brucei. Although this disease is currently considered as a public health problem, there is neither a vaccine nor a drug available to prevent HAT. Therefore, the control of the vector and the treatment of patients are the only tools available to combat this disease. When untreated, the disease can be lethal leading to death within a few months. Treatment with first-line drugs, for the acute and chronic phases of the disease, includes chemotherapy with agents that generate serious side effects, such as suramin, pentamidine, melarsoprol, and eflornithine. Recently, an alternative approach in the treatment of HAT includes considering the parasite T. brucei as a "blood tumor cell", since it shares some properties with blood cancer cells, such as the eukaryotic nature, the niche in the bloodstream and a high proliferation rate. These properties should allow modeling the treatment of HAT by using tools including routine usage of inhibitors against the control mechanism of the cell cycle. In this sense, the understanding of the mechanisms involved in the control of the parasite cell cycle can contribute significantly to the development of anti-trypanosomes therapies. In this work, we analyzed the molecular mechanisms involved in the process of checkpoint and DNA repair of T. brucei in response to double DNA strand-breaks (DSBs). After ionizing radiation (IR) treatment, T. brucei activates checkpoint pathways coordinated by the tripanosomal PI3KKs kinases (especially ATM and ATR). This response is dependent on the cell cycle phases of the parasite during the DNA damage. After DSBs, ATM showed to have a main role controlling the G1/S and intra-S transition of the cell cycle, while ATR exhibits essential functions at intra-S checkpoint, as well as in the passage of parasites into G2/M phases after damage, but discrete role in G1/S transition. Adittional, during the late S/G2 phases, after DNA damage, the gH2A chromatin marker is phosphorylated and the homologous recombination (HR) machinery is sequentially recruited for DNA, triggering the repair of the DSBs via RAD51 in approximately 6 h, under the regulation of the ATR kinase. Our results suggest that this mechanism is absent in the G1/early S phases and our hypothesis is that an HR-independent mechanism acts in the repair of DSBs taking more than 6 h to be completed. Finally, we showed that Pentamidine, a first-line drug used in the treatment of acute HAT, generates DNA breaks and activates a signaling pathway that phosphorylates gH2A. Using ATM and/or ATR kinase inhibitors, we observed the sensitization of parasites against the drug, evidenced by the greater detection of DSBs. Together, these data show that the knowledge of the cell cycle in trypanosomes, as well as the mode of action of drugs, can lead to the development of combined therapies that should assist in the control of diseases caused by these parasites.