Os aminoácidos participam de vários processos importantes na biologia dos tripanossomatídeos, como osmorregulação, diferenciação celular e invasão de células hospedeiras. Alguns deles fornecem poder redutor para a síntese de ATP mitocondrial. Foi anteriormente demonstrado que a alanina, que é formada principalmente pela aminação do piruvato, é um produto final metabólico quando os parasitas estão proliferando em um meio rico em glicose e aminoácidos. Mostrou-se também que este aminoácido também pode ser usado para a regulação do volume celular e resistência ao estresse osmótico. Curiosamente, o Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, possui genes putativos para uma Alanina racemase (AR) que catalisam a interconversão entre L e D-alanina. Aqui mostramos, pela primeira vez, que os genes putativos TcAR_A em T. cruzi codificam a enzima recombinante funcional (rTcAR_A) bioquímicamente caracterizada e localizada no citoplasma. A atividade da AR foi detectada através do ciclo de vida dos parasitas. Demonstramos também que a TcAR_A racemiza a serina com parâmetros cinéticos semelhantes aos da Ala. Também demonstramos que ambos isómeros da Ala podem ser transportadas e através de um sistema ativo não estereosseletivo de baixa especificidade. Ambas, L-Ala, e D-Ala, podem ser completamente oxidadas em CO2, fornecendo elétrons para a cadeia de transporte de elétrons, sustentando OXPHOS em epimastigotas de T. cruzi. Como não tem sido descrita em hospedeiros mamíferos uma AR, investigamos a atividade antiparasitária das tiadiazolidinonas, uma nova classe de inibidores de AR. Todos os inibidores testados exibiram uma inibição da replicação dos epimastigotas dependente da dose. Esses compostos também inibiram a atividade da rTcAR_A. Como o inibidor C3 mostrou uma menor concentração inibitória de 50% (IC50) contra o crescimento de epimastigotas, o mecanismo de ação deste fármaco foi estudado em maior detalhe. C3 induz marcas típicas de morte celular programada em T. cruzi. De facto, os parasitas tratados exibiram uma exposição de fosfatidilserina na fase externa da membrana celular, diminuição do potencial de membrana mitocondrial, , um aumento da concentração intracelular de ROS, e fragmentação de DNA. C3 apresentou um efeito inibitorio sobre o ciclo de infecção celular a concentrações na faixa submicromolar , com um alto índice de seletividade. Estes compostos também mostraram um interessante efeito anti-T. brucei, com similares características de ação. Em conjunto, nossos dados demonstram o papel versátil de Ala na bioenergética do parasita podendo ser secretado, ou transportado para o méio intracelular para ser oxidado pelos parasitas. Além disso, o catabolismo da D-Ala, através da AR, chama a atenção sobre a flexibilidade metabólica de T. cruzi, bem como sobre a relevância do metabolismo dos D-aminoácidos nesses organismos. Nossos resultados também mostraram que o AR pode ser um alvo promissor para a quimioterapia.

Amino acids participate in several critical processes in the biology of trypanosomatids, such as osmoregulation, cell differentiation and host cell invasion. Some of them provide reducing power for mitochondrial ATP synthesis. It was previously shown that alanine, which is formed mainly by the amination of pyruvate, is a metabolic end-product when parasites are replicating in a medium rich in glucose and amino acids. It was shown as well that this amino acid can also be used for the regulation of the cell volume and the resistance to osmotic stress. Interestingly, Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagass disease, possess putative Alanine racemase (AR) genes that catalyze the interconversion between L- and D-alanine. Here we describe, for the first time, that the putative TcAR_A genes in T. cruzi encode a functional recombinant enzyme (rTcAR_A) that was biochemically characterized and localized in the cytoplasm. AR activity was detected through parasites life cycle. We demonstrated that TcAR_A, also racemize serine with similar kinetic parameters. In this work, we also show that both isomers can be taken up and through a low specificity non-stereoselective active transport system. We show that L-Ala and as well D-Ala, through it conversion to the L-isomer by TcAR_A, can be completely oxidized to CO2, supplying electrons for OXPHOS in T. cruzi epimastigotes. As AR had not been described in mammalian host, we investigated the anti-T. cruzi activity of the thiadiazolidinones, new class of potential AR inhibitors. All, the compounds exhibited dose-dependent inhibition of epimastigote replication and also inhibited the rTcAR_A activity. As C3 had shown a lower 50% inhibitory concentration (IC50) against epimastigote growth, the mechanism of action of this drug was studied in more detail. C3 induces typical programed cell death (PCD) hallmarks in T. cruzi. Indeed, treated parasites exhibited a phosphatidylserine exposure in the external leaflet of the plasma membrane, a decrease of the mitochondrial membrane potential, an intracellular ROS concentration deregulation, and nuclear DNA fragmentation. C3 exhibits a submicromolar range in the intracellular cell cycle infection with a high selectivity index. These compounds also induced an interesting anti-T. brucei with a similar mechanism of action. Taken together, our data demonstrate the versatile role for Ala in the parasites bioenergetics being secreted as well taken up and oxidized by the parasites. Moreover, the catabolism of D-Ala, through AR, underlines the parasites outstanding parasites metabolic flexibility as well the relevance of the D-amino acids metabolism in these organisms. Our results also showed that AR could be a promising target for chemotherapy.