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Mémoire de Maîtrise
DOI
10.11606/D.42.2014.tde-12082014-140851
Document
Auteur
Nom complet
Thales Kronenberger
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2013
Directeur
Jury
Wrenger, Carsten (Président)
Iulek, Jorge
Trossini, Gustavo Henrique Goulart
Titre en portugais
Implicações estruturais de mutantes da piridoxal quinase de Plasmodium falciparum
Mots-clés en portugais
Dinâmica molecular
Malária
Modelagem molecular
Piridoxal quinase
Vitamina B6
Resumé en portugais
O metabolismo de vitamina B9 é um alvo terapêutico conhecido para malária. A vitamina B6 foi validada como essencial para o parasita. Esse trabalho analisa bioquimica- e estruturalmente mutantes da enzima piridoxal quinase, pela combinação de análises in silico associadas a ensaios bioquímicos. A estrutura da PdxK de P. falciparum permitiu a localização do sítio ativo e da interface de dimerização. Logo foram sugeridas mutações que alterassem esses resíduos para investigar sua importância. Dinâmica molecular sugere que a dimerização é responsável pela estabilidade do sítio ativo, algo coerente com a diminuição da atividade enzimática na maioria das mutantes. Filtração em gel aponta um equilíbrio entre a conformação monômero-dímero mostrando que as mutações na interface não estão relacionadas a dimerização, mas envolvidas com a estabilização do folding na região do sítio ativo. A mesma é recoberta por uma tampa que impede a auto-hidrólise do ATP, há também um resíduo serina que estabiliza a conformação do piridoxal durante a catálise, as mutações em ambas as regiões levaram a inativação da enzimática. A hipótese de que a interação da PfPdxK com ligantes de RNA não se mostrou conclusiva.
Titre en anglais
Structural implication of mutans of the pyridoxal kinase from Plasmodium falciparum.
Mots-clés en anglais
Malaria
Molecular dynamics
Molecular modelling
Pyridoxal kinase
Vitamin B6
Resumé en anglais
Vitamin B9 metabolism is a known drug-target for malaria. Vitamin B6 was validated as essential for the parasite. We analysed biochemically and structurally the plasmodial dimeric pyridoxal kinase. PfPdxKs allowed us to determine the localisation of the active site as well the interface between the two monomers and to identify the involved residues. Molecular dynamics shows that the PdxKs dimerization is important for the active sites stability, which was confirmed by the decrease of activity in mutants related to this region. Gel filtration revealed equilibrium of monomer-dimer conformation and therefore the interface mutations decrease in activity might not be directly related to the dimerization processes, but rather to the active site organisation. The active site region shows a serine involved in keeping the pyridoxals conformation during catalyses and the identified lid region covering the ATP binding site is responsible for preventing auto-hydrolysis. Substitution of the respective amino acid to alanine resulted in enzyme inactivation. In silico analysis of the PfPdxK spacer region identified nucleic acid binding sides, however RNA binding experiments failed so far and the possibility of protein-RNA binding remains for elucidation.
 
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Date de Publication
2014-08-12
 
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