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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.42.2018.tde-09032023-180834
Documento
Autor
Nome completo
Pamela Omena Petravicius
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2018
Orientador
Banca examinadora
Zingales, Bianca Silvana (Presidente)
Freitas, Carolina Borsoi Moraes Holanda de
Mestriner, Clara Lúcia Barbieri
Uliana, Silvia Reni Bortolin
Título em português
Busca de novos compostos anti-Trypanosoma cruzi e mapeamento da resistência natural a benznidazol em tripanossomatídeos
Palavras-chave em português
Derivados de quinazolina e de oxadiazol
Filogenia
Nitroredutase I
Old yellow enzyme
Resistência natural a benznidazol
Superóxido dismutase dependente de ferro
Transportador ABCG1
Tripanossomatídeos
Resumo em português
A busca de novos compostos para o tratamento da doença de Chagas (DC) e o entendimento dos fatores envolvidos na resistência natural de cepas de Trypanosoma cruzi a benznidazol (BZ), fármaco de primeira escolha no tratamento da DC, são prioridades de pesquisa. Neste estudo, quatro compostos derivados de quinazolina e quatro de oxadiazol tiveram sua atividade avaliada contra formas epimastigotas de duas cepas de T. cruzi. Apenas o composto 4-(1H-benzo[d]imidazol-2-il-tio)-6,7-metoxiquinazolina mostrou atividade tripanocida promissora, com valores de CI50 da ordem de 14 M. Por outro lado, esse composto apresentou elevada citotoxicidade para células LLC-MK2, promovendo a morte de 70% das células na concentração de 5 M. Esta característica não torna o composto atraente como um candidato a fármaco para a DC. Em seguida, determinamos a sensibilidade a BZ in vitro em espécies da família Trypanosomatidae e em representantes de clados do gênero Trypanosoma, totalizando 14 organismos. A atividade do composto foi avaliada em parasitos em fase exponencial de crescimento, em meio de cultura e temperaturas adequadas, após incubação de 72h, utilizando o ensaio com o corante de tetrazólio MTT. Foram consideradas espécies sensíveis a BZ aquelas que apresentaram valores de CI50 entre 3 e 25 M: representantes do gênero Trypanosoma (T. cruzi, T. c. marinkellei, T. rangeli e T. b. brucei) e P. serpens. Foram consideradas espécies resistentes a BZ aquelas que tiveram uma inibição de crescimento apreciável apenas a partir de 40 M: representantes do gênero Leishmania [L. (L.) infantum, L. (V.) braziliensis, L. (L.) tarentolae e L. (L.) enriettii]; C. fasciculata, A. deanei, S. galati, T. dionisii e Paratrypanosoma sp. A maior taxa de resistência foi observada nos isolados de T. dionisii, C. fasciculata, S. galati, L. (V.) braziliensis e L. (L.) enriettii nos quais a inibição do crescimento promovida por 160 M de BZ é da ordem de 20%. Um dos fatores que podem estar relacionados com a resistência a BZ em Leishmania refere-se à taxa de captação do fármaco, que, em L. (L.) infantum, é cerca de 6 vezes menor que em T. cruzi. Por sua vez, P. serpens (sensível a BZ) apresenta a mesma taxa de captação de T. cruzi. Objetivando analisar características de proteínas previamente associadas com a resistência a BZ em T. cruzi, resgatamos em bancos de dados de tripanossomatídeos as sequências da Nitroredutase I (NTR), da Old Yellow Enzyme (OYE), da Fe-superóxido dismutase A (FeSOD-A) e do transportador ABCG1. Encontramos ortólogos de NTR, FeSOD-A e ABCG1 em todas as espécies. Não encontramos ortólogos de OYE em P. serpens e em tripanossomas Africanos. O alinhamento das sequências é aqui mostrado. Árvores filogenéticas foram construídas para as quatro proteínas, observando-se que as árvores da NTR, da FeSOD-A e de ABCG1 seguem o padrão filogenético de evolução das espécies obtido por marcadores moleculares clássicos. Os dados obtidos neste estudo serão úteis para investigações futuras, visando avaliar a atividade dos marcadores de resistência putativos e/ou o efeito da superexpressão ou silenciamento dos genes correspondentes.
Título em inglês
Search for new anti-Trypanosoma cruzi compounds and mapping of the natural resistance to benznidazole in trypanosomatids.
Palavras-chave em inglês
ABCG1 transporter
Benznidazole resistance
Fe-superoxide dismutase
Nitroreductase I
Old yellow enzyme
Phylogeny
Quinazoline and oxadiazol derivatives
Trypanosomatids
Resumo em inglês
The search for new compounds for the treatment of Chagas disease (CD) and the understanding of the elements involved in the natural resistance of Trypanosoma cruzi strains to benznidazole (BZ), the first choice drug for the treatment of CD, are research priorities. Here, four compounds derived from quinazoline and four from oxadiazol had their activity evaluated against epimastigote forms of two T. cruzi strains. Only 4-(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio)-6,7-methoxyquinazoline showed promising trypanocidal activity, with IC50 values of ~ 14 M. On the other hand, this compound had high cytotoxicity to LLC-MK2 cells, promoting the death of 70% of the cells at 5 M concentration. This feature does not make the compound attractive as a drug candidate for CD. Next, we determined BZ in vitro sensitivity in species of the Trypanosomatidae family and in representatives of Trypanosoma clades, totalizing 14 organisms. The drug activity was evaluated in parasites in the exponential growth phase, in appropriate culture medium and temperatures, after incubation for 72h, using the MTT tetrazolium dye assay. BZ-susceptible species were considered those that exhibited IC50 values from 3 to 25 M: representatives of the genus Trypanosoma (T. cruzi, T. c. marinkellei, T. rangeli, and T. b. brucei) and P. serpens. BZ-resistant species were considered those that had significant growth inhibition only from 40 M: representatives of the genus Leishmania [L. (L.) infantum, L. (V.) braziliensis, L. (L.) tarentolae, and L. (L.) enriettii]; C. fasciculata, A. deanei, S. galati, T. dionisii and Paratrypanosoma sp. The highest resistance rate was observed in T. dionisii, C. fasciculata, S. galati, L. (V.) braziliensis and L. (L.) enriettii isolates, in which 20% growth inhibition was promoted by 160 M BZ. One of the factors that may be related to BZ resistance in Leishmania refers to the rate of drug uptake, which in L. (L.) infantum is about 6-fold lower than in T. cruzi. In turn, P. serpens (sensitive to BZ) presents the same rate of T. cruzi uptake. In order to analyze the characteristics of proteins previously associated with BZ-resistance in T. cruzi, we retrieved from trypanosomatid databases the sequences of Nitroreductase I (NTR), Old Yellow Enzyme (OYE), Fe-superoxide dismutase A (FeSOD-A) and the ABCG1 transporter. NTR, FeSOD-A and ABCG1 orthologs were found in all species. OYE orthologs were not represented in P. serpens and African trypanosomes. Sequence alignments are here presented. Phylogenetic trees were constructed for the four proteins, showing that the NTR, FeSOD-A and ABCG1 trees follow the phylogenetic pattern of evolution of the species obtained by classical molecular markers. The data reported in this study will be valuable for future investigation aimed at assessing the activity of putative drug resistance markers and/or the effect of the overexpression or silencing of the corresponding genes.
 
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Data de Liberação
2025-03-12
Data de Publicação
2023-03-22
 
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