Flagelados do gênero Trypanosoma são parasitas obrigatórios de todas as classes de vertebrados e estão divididos em duas linhagens filogenéticas principais: o clado terrestre, composto por tripanossomas de mamíferos, serpentes, lagartos, crocodilianos e aves, e o clado aquático, que contém tripanossomas de sanguessugas e de vertebrados aquáticos (peixes) ou semiaquáticos (quelônios, anuros e ornitorrinco). Pouco se sabe sobre a diversidade, relações filogenéticas e filogeografia de tripanossomas que infectam hospedeiros não mamíferos. Neste trabalho, analisamos vertebrados aquáticos e semi-aquáticos com o objetivo de avaliar a prevalência e a diversidade de tripanossomas que parasitam esses hospedeiros. Foram utilizadas sequências dos genes gGAPDH e SSU rRNA para inferências filogenéticas e levantamentos de tripanossomas em amostras de sangue de crocodilianos (sul-americanos e africanos), peixes e tartarugas com o objetivo de identificar possíveis vetores, do trato digestivo de tabanídeos e sanguessugas. Tripanossomas de crocodilianos e tabanídeos foram obtidos por hemocultura. Comportamento in vitro (formas em cultura), morfologia e características ultraestruturais complementam a descrição molecular de novas espécies definidas em análises filogenéticas. Inicialmente, tripanossomas que parasitam jacarés neotropicais foram identificados em Caiman crocodilos, C. yacare, Melanosuchus niger e Paleosuchus trigonatus da Amazônia, Pantanal e Cerrado. Inferências filogenéticas foram realizadas visando: a) avaliar a relação entre os hospedeiros e a geografia na diversidade e relações filogenéticas dos tripanossomas de crocodilianos; b) formular hipóteses biogeográficas consistentes com as histórias evolutivas dos tripanossomas, bem como de seus hospedeiros crocodilianos. As análises revelaram um clado exclusivo de tripanossomas de crocodilianos, posicionado no clado terrestre e composto por 4 subclados: 1) subclado (Africano) que compreende Trypanosoma gray de C. niloticus e moscas tsé-tsé; 2) subclado de tripanossomas de jacarés, representado por Trypanosoma ralphi n. sp. de M. niger, C. crocodilus e C. yacare de diferentes bacias hidrográficas brasileiras; 3) subclado formado por Trypanosoma terena n. sp. de C. yacare, compartilhando hospedeiros e bacias hidrográficas com T. ralphi e incluindo tripanossomas de C. crocodilus do rio Orinoco (Venezuela) e do crocodilo africano O. tetraspis; 4) subclado (Cay03) representado por tripanossomas de C. crocodilus e M. niger da Amazônia. A estreita relação filogenética entre tripanossomas sul-americanos e africanos é consistente com a recente dispersão transoceânica do gênero Crocodylus durante o Mioceno/Plioceno (4-5 Ma) e com tripanossomas trocando de hospedeiros durante a configuração geológica das bacias hidrográficas sulamericanas, moldando, assim, as histórias evolutivas dos crocodilianos e de seus tripanossomas. Um levantamento realizado por PCR e sequenciamento em amostras de sangue de jacarés e de sanguessugas coletadas nestes animais revelou novos tripanossomas e infecções mistas frequentes. Análises filogenéticas revelaram uma nova espécie posicionada no clado aquático (Trypanosoma clandestinus n. sp.), próxima aos tripanossomas de peixes e detectada em C. yacare, C. crocodilus e M. niger do Pantanal e Amazônia. Um grande número de epimastigotas em divisão e tripomastigotas longos e delgados foram encontrados no tubo digestivo de sanguessugas (Haementeria sp.) removidas da cavidade oral de jacarés, apresentando sequências idênticas às determinadas em T. clandestinus. Infestação experimental de jacarés jovens com sanguessugas infectadas resultou em infecções prolongadas que nos permitiram delinear o ciclo de vida de T. clandestinus, que, até o momento, é a primeira espécie de tripanossoma de crocodilianos transmitida por sanguessugas e posicionada no clado aquático, relacionada com tripanossomas de peixes. A fim de investigar possíveis vetores de tripanossomas de crocodilianos neotropicais, examinamos tabanídeos coletados enquanto se alimentavam de jacarés e os resultados revelaram alta prevalência de insetos positivos para tripanossomas. Análises filogenéticas de sequências obtidas a partir do trato digestivo desses tabanídeos revelaram a presença de T. terena, T. ralphi e duas novas espécies do clado terrestre, enquanto que T. clandestinus não foi detectado. Uma nova espécie de tripanossoma de crocodilo, T. kaiowa n. sp., apresentando características comportamentais e morfológicas únicas, foi obtida em cultura a partir de tabanídeos e sangue de jacarés. Enquanto a maioria dos tabanídeos apresentou infecções mistas (65%), um deles, albergando exclusivamente T. kaiowa n. sp, foi usado para estudar o desenvolvimento no vetor e delinear o ciclo de vida desse tripanossoma. Portanto, nossos 11 dados mostraram que os jacarés podem albergar tripanossomas dos clados aquático (transmitidos por sanguessugas) e terrestre (tabanídeos), muitas vezes simultaneamente. Este trabalho também investigou a prevalência e a diversidade dos tripanossomas de peixes, amplamente distribuídos e altamente prevalentes em peixes de água doce e marinhos, incluindo teleósteos e elasmobrânquios. Anteriormente a este estudo, todas as espécies de tripanossomas de peixes da América do Sul foram identificadas com base em parâmetros não confiáveis como morfologia e hospedeiro de origem. Este é o primeiro estudo que realizou análises filogenéticas (complementadas por dados morfológicos) de tripanossomas de peixes sul-americanos (brasileiros) e de sanguessugas retiradas de peixes. Apesar de divergências relevantes, as análises agruparam todos os tripanossomas de peixes brasileiros e das respectivas sanguessugas em um único clado. Tripanossomas encontrados no sangue de peixes e em sanguessugas revelaram-se altamente pleomórficos, o que é consistente com a divergência de sequências, sugerindo que muitas espécies infectam peixes, muitas vezes em infecções mistas. Filogenias moleculares e a morfologia desses tripanossomas foram usadas para descrever duas novas espécies. Trypanosoma abeli n. sp. é a primeira espécie de peixe da América do Sul a ser isolada em cultura, posicionada em árvores filogenéticas e caracterizada a nível de ultra-estrutura. Trata-se de espécie altamente prevalente em Hypostomus luetkeni e H. affinis (cascudos do bioma Atlântico), sendo também encontrada in cascudos da Amazonia e Pantanal. A segunda espécie de tripanossoma de peixe descrita no presente estudo é Trypanosoma sp. (traíra), detectada em Hoplias malabaricus e em sanguessuga do gênero Haementeria, e caracterizada por PCR-sequenciamento e morfologia em esfregaços sanguíneos de peixes e intestino de sanguessugas encontradas no Pantanal e na Amazônia. Os levantamentos por PCR-sequenciamento demonstraram que peixes e sanguessugas (que albergam tripanossomas de peixes, tartarugas e jacarés) geralmente apresentam infecções mistas. Nossos resultados fortemente suportam grandes distâncias genéticas que separam os tripanossomas de peixes Neotropicais (que incluem clados exclusivamente de cascudo e traíra) dos peixes da Europa, América do Norte e África. De fato, os tripanossomas de peixes Neotropicais estão mais relacionados ao tripanossoma Neotropical T. clandestinus (jacarés) e a tripanossomas de quelônios. As análises filogenéticas de tripanossomas de tartarugas Neotropicais (espécies aquáticas dos gêneros Mesoclemmys e Podcnemis) e jabutis (espécies terrestres do gênero Chelonoidis spp.), comparada com tripanossomas de tartarugas da África (Trypanosoma mocambicum de Pelusios sp.) e Austrália (Trypanosoma chelodina) revelaram que: 1) todos os tripanossomas de quelônios, independentemente se de tartarugas de água doce ou jabutis, agruparam no clado aquático, exibindo complexas relações com tripanossomas de peixes, jacarés e ornitorrinco; 2) grandes distâncias genéticas separam os tripanossomas Neotropicais e Afro-tropicais de quelônios. Em um cenário evolutivo plausível, as relações filogenéticas entre tripanossomas de peixes, tartarugas e jacarés estão mais relacionadas à origem geográfica do que às relações filogenéticas com seus hospedeiros vertebrados. Muito provavelmente, um tripanossoma ancestral comum diversificou e adaptou-se a diferentes vertebrados, possivelmente mediante troca de hospedeiro mediada por sanguessugas aquáticas que se alimentam de todos esses hospedeiros.

Flagellates of the genus Trypanosoma, obligate parasites of all vertebrate classes, are distributed into two major phylogenetic lineages: the Terrestrial clade composed of trypanosomes of mammals, snakes, lizards, crocodilians and birds and the Aquatic clade containing trypanosomes of leeches, and aquatic (fishes) or semi-aquatic (chelonians, anurans and platypus) vertebrate hosts. To date, little is known about the diversity, phylogenetic relationships, and phylogeography of trypanosomes infecting non-mammalian hosts. In this work, we surveyed aquatic and semi aquatic vertebrate, leeches and tabanids aiming to assess trypanosome prevalence and diversity. SSU rRNA and gGAPDH genes were employed for surveys of trypanosomes in blood samples of crocodilians, fishes, turtles, and gut contents of tabanids and leeches, and for phylogenetic inferences. We characterized trypanosomes from South American alligatorids and African crocodiles. In addition, leeches and tabanids were examined aiming to identify possible vectors. Trypanosomes from crocodilians and tabanids were obtained by haemoculturing. Growth behaviour, morphology, and ultrastructural features complement the molecular description of new species that are strongly supported by phylogenetic analyses.Trypanosomes parasitizing Neotropical alligatorids were identified in Caiman crocodilus, C. yacare, Melanosuchus niger and Paleosuchus palpebrosus from Amazonia, Pantanal and Cerrado biomes. Phylogenies were inferred aiming: a) to evaluate the relative forces of host species and geography in shaping the genetic diversity, phylogenetic relationships and distribution of crocodilian trypanosomes; b) to hypothesize biogeographical scenarios consistent with both trypanosome and crocodilian evolutionary histories. The phylogenetic analyses disclosed a strongly supported crocodilianrestricted assemblage within the terrestrial clade of Trypanosoma, comprising four clades: 1) subclade composed of African Trypanosoma grayi from C. niloticus and tsetse flies; 2) subclade comprising alligatorid trypanosomes represented by Trypanosoma ralphi n. sp. from M. niger, C. crocodilus and C. yacare from Brazilian river basins; 3) subclade formed by Trypanosoma terena n. sp. from C. yacare, sharing hosts and basins with T. ralphi, this subclade included trypanosomes from C. crocodilus from the Orinoco (Venezuela) and the African crocodilian O. tetraspis; 4) subclade Cay03 represented by trypanosomes from C. crocodilus and M. niger from Amazonia. The close relationship between South American and African trypanosomes is consistent with recent transoceanic dispersal of Crocodylus at the Miocene/Pliocene boundaries (45 mya), and host-switching of trypanosomes throughout the geological configuration of South American hydrographical basins. A PCR-survey for trypanosomes in caiman blood samples and in leeches taken from caimans revealed unknown trypanosome diversity and frequent mixed infections. Phylogenetic analyses revealed a new species nesting in the Aquatic clade and named Trypanosoma clandestinus n. sp., found in C. yacare, C.crocodilus and M. niger from the Pantanal and Amazonia. Large numbers of dividing epimastigotes and unique thin and long trypomastigotes were found in the guts of leeches (Haementeria sp.) removed from the mouths of caimans; these trypanosomes share identical sequences with T. clandestinus. Experimental infestation of young caimans with infected leeches resulted in long-lasting infections that permitted us to delineate the life cycle of T. clandestinus; which is the first crocodilian trypanosome known to be transmitted by leeches, and positioned in the aquatic clade closest to fish trypanosomes. To investigate possible vectors of trypanosomes from Neotropical crocodilians, we surveyed tabanid flies collected while feeding on caimans, and results revealed large prevalence of flies positive for trypanosomes. Phylogenetic analyses of sequences obtained from tabanid guts revealed T. terena, T.ralphi plus two new trypanosome species of the terrestrial clade, but not T. clandestinus. One new species, herein referred as to Trypanosoma kaiowa n. sp., was identified in cultures from both tabanids and blood of caimans. This species exhibited unique behavioral and morphological features. Most tabanids infections (65%) were mixed infections; however, one fly harboring exclusively T. kaiowa was used to assess its development in tabanids, and to delineate its putative life cycle. Therefore, our data show that caimans can host trypanosomes nested in both aquatic (transmitted by leeches) and terrestrial (tabanid flies) clades, many times simultaneously. In this work, we also investigated the genetic diversity of fish trypanosomes, which are widespread and highly prevalent in freshwater and marine fishes, including teleost and elasmobranch species. Before this 13 study, all South American fish trypanosomes have been identified based on unreliable morphological and host origin parameters. We performed the first phylogenetic analyses (complemented by morphological data) of South American (Brazilian) trypanosomes from fishes, and leeches taken from fishes. Phylogenetic analyses showed that despite relevant divergences, all Brazilian fish trypanosomes and respective leech trypanosomes clustered together. Trypanosomes were highly pleomorphic in blood and leeches samples, in agreement with sequence data suggesting many species of trypanosomes infecting Brazilian fishes, often as mixed infections. Phylogeny and morphology of these trypanosomes were used to described two new species. Trypanosoma abeli n. sp., the first trypanosome from South American fish isolated in culture, positioned in phylogenetic trees and characterized at the ultrastructural level. This species is highly prevalent in the armoured catfish Hypostomus luetkeni and H. affinis from the Atlantic Forest, and was also found in catfishes from Amazonia and the Pantanal. The second species of fish trypanosome described in the present study is Trypanosoma sp. (trahira), detected in Hoplias malabaricus and leech of Haementeria, and characterized by PCR-sequencing and morphology either in fish blood smears and gut of leeches, so far found in the Pantanal and Amazonia. PCR-sequencing surveys demonstrated that fishes and leeches (harboring trypanosomes from fishes, turtles and caimans) often have mixed trypanosome infections. Our findings provide strong support for large genetic distances separating trypanosomes from Neotropical fishes (comprising clades exclusively of catfishes or trahira) from those of fishes from Europe, North America and Africa. In fact, trypanosomes of Neotropical fishes were more related to Neotropical T. clandestinus (caimans) and trypanosomes of chelonians. The phylogenetic analysis of trypanosomes from Neotropical turtles (aquatic species of Mesoclemmys and Podcnemis) and tortoise (terrestrial Chelonoidis spp.), compared with trypanosomes of turtles from Africa (Trypanosoma mocambicum from Pelusios sp.) and Australia (Trypanosoma chelodina) revealed that: 1) all trypanosomes from chelonians regardless from turtles or tortoises nested into the aquatic clade, exhibiting a tangled relationships intermingled with trypanosomes from fishes, caimans and platypus; 2) Neotropical and Afrotropical trypanosomes from chelonians are separated by very large genetic distances. In a plausible evolutionary scenario, the phylogenetic relationships among trypanosomes from fishes, turtles and caimans are more related to geographic origin than to phylogenetic relationships of their vertebrate hosts. Most likely, a common ancestor trypanosome diversified and adapted to different hosts, probably through host switching possible mediated by aquatic leeches that feed on all these hosts.