Análise de interatores da proteína Orc1/Cdc6 de Trypanosoma cruzi.

Lima, Loyze Paola Oliveira de

doi:10.11606/T.42.2019.tde-04052023-180819

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Tese de Doutorado

DOI

https://doi.org/10.11606/T.42.2019.tde-04052023-180819

Documento

Tese de Doutorado

Autor

Lima, Loyze Paola Oliveira de (Catálogo USP)

Nome completo

Loyze Paola Oliveira de Lima

Unidade da USP

Instituto de Ciências Biomédicas

Área do Conhecimento

Biologia da Relação Patógeno-Hospedeiro

Data de Defesa

2019-05-23

Imprenta

São Paulo, 2019

Orientador

Sabbaga, Maria Carolina Quartim Barbosa Elias (Catálogo USP)

Banca examinadora

Sabbaga, Maria Carolina Quartim Barbosa Elias (Presidente)
Ávila, Andrea Rodrigues
Galhardo, Rodrigo da Silva
Tonelli, Renata Rosito

Título em português

Análise de interatores da proteína Orc1/Cdc6 de Trypanosoma cruzi.

Palavras-chave em português

Orc1/Cdc6, DNA polimerase theta,
Replicação do DNA
Trypanosoma cruzi

Resumo em português

Aproximadamente dez milhões de pessoas, predominantemente na América Latina, são acometidas pela doença de Chagas, causada pelo Trypanosoma cruzi. Apesar disso, essa enfermidade apresenta investimentos reduzidos em pesquisas e produção de medicamentos. As drogas atualmente disponíveis para tratar essa doença têm efeitos tóxicos e não são eficazes contra todas as fases da doença ou cepas de parasitas, tornando necessário estudos que apresentem alvos terapêuticos específicos. Nesse contexto, nosso laboratório estuda a replicação do DNA em Trypanosoma, uma vez que caracterizar a replicação deste parasita pode servir como uma ferramenta para buscar possíveis alvos terapêuticos. Neste estudo, investigamos o papel da proteína DNA Polimerase theta-domínio helicase (Pol-helicase) na replicação do T. cruzi. A DNA polimerase theta (Pol) de eucariontes recentes é um membro da família de polimerase e exibe um domínio C-terminal da polimerase, um domínio central e um domínio de helicase N-terminal. A proteína Pol desempenha importantes papéis no reparo do DNA através de seu domínio polimerase, regulando a integridade do genoma. Além disso, em mamíferos, a Pol modula o tempo de disparo da origem e o recrutamento da helicase MCM para a cromatina. Em contraste, o genoma de T. cruzi exibe dois ortólogos putativos individuais de Pol em diferentes locos do genoma; um homólogo ao domínio da polimerase do terminal C de Pol e o outro homólogo ao domínio da helicase, denominado Pol-polimerase e Pol-helicase, respectivamente. Neste estudo, um ensaio de pull-down usando o componente T. cruzi do complexo de pré-replicação Orc1/Cdc6 como isca capturou Pol-helicase do extrato nuclear. Orc1/Cdc6 e Pol-helicase interagiram diretamente e a Pol-helicase recombinante apresentou atividade de desenrolamento do DNA e de ATPase. Além disso, uma cepa de T. cruzi superexpressando o domínio Pol-helicase exibiu uma quantidade significativamente menor de MCM7 ligado ao DNA e prejudicou o disparo na origem da replicação. Utilizamos a metodologia de CRISPR-Cas9 para gerar uma linhagem que expressa a Pol-helicase sem o domínio de helicase, observamos que essa linhagem, de fato, apresentou mais MCM no DNA. Em conjunto, esses dados sugerem que a Pol-helicase modula a replicação do DNA interagindo diretamente com Orc1/Cdc6, o que reduz a ligação do MCM7 ao DNA e, assim, prejudica o disparo das origens de replicação.

Título em inglês

Analysis of the interactors of the Orc1 / Cdc6 protein of Trypanosoma cruzi.

Palavras-chave em inglês

Trypanosoma cruzi
DNA polymerase theta
DNA replication
Orc1/Cdc6

Resumo em inglês

Approximately 10 million people, predominantly in Latin America, are affected by Chagas' disease, caused by Trypanosoma cruzi. Despite this, we observe a reduced investment in research and production of new drugs against this parasite. Drugs available to treat this disease have toxic effects and are not effective against all stages of the disease or strains of parasites. Therefore, studies that have specific therapeutic targets are important and necessary. In this context, our laboratory studies DNA replication in Trypanosoma, since components acting in the replication of this parasite can be viewed as therapeutic targets. In this study, we investigated the role of the protein DNA polymerase theta helicase domain (Pol-helicase) in T. cruzi DNA replication. DNA polymerase theta (Pol) from recent eukaryotes is a member of the polymerase family and exhibits a polymerase C-terminal domain, a central domain and a helicase N-terminal domain. The Pol protein plays important roles in DNA repair, regulating the integrity of the genome. In addition, in mammals, Pol modulates the replication origin firing and recruitment of the MCM helicase to the chromatin. In contrast, the T. cruzi genome exhibits two individual putative orthologues of Pol in different loci of the genome; a polymerase domain homolog of the C-terminal of Pol and a homologous to the helicase domain, designated Pol-polymerase and Pol-helicase, respectively. In this study, a pull-down assay using the T. cruzi component of the prereplication complex Orc1/Cdc6 as bait captured Pol-helicase from the nuclear extract. Orc1/Cdc6 and Pol-helicase directly interacted, and Pol-helicase presented DNA unwinding and ATPase activities. T. cruzi strain overexpressing the Pol-helicase domain exhibited a significantly decreased amount of DNA-bound MCM7 and impaired replication origin firing. Taken together, these data suggest that Pol-helicase modulates DNA replication by directly interacting with Orc1/Cdc6, reducing the binding of MCM7 to DNA and thereby impairs the firing of replication origins.

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Data de Liberação
2025-05-03

Data de Publicação
2023-05-22

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