O ensaio de interferência de proteínas oligoméricas como método de validação de alvos antimaláricos.

Batista, Fernando de Assis

doi:10.11606/T.42.2019.tde-02022024-183635

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Tese de Doutorado

DOI

https://doi.org/10.11606/T.42.2019.tde-02022024-183635

Documento

Tese de Doutorado

Autor

Batista, Fernando de Assis (Catálogo USP)

Nome completo

Fernando de Assis Batista

Unidade da USP

Instituto de Ciências Biomédicas

Área do Conhecimento

Biologia da Relação Patógeno-Hospedeiro

Data de Defesa

2019-12-09

Imprenta

São Paulo, 2019

Orientador

Wrenger, Carsten (Catálogo USP)

Banca examinadora

Wrenger, Carsten (Presidente)
Lotufo, Leticia Veras Costa
Schmidt, Martina
Wunderlich, Gerhard

Título em português

O ensaio de interferência de proteínas oligoméricas como método de validação de alvos antimaláricos.

Palavras-chave em português

Plasmodium falciparum
Ensaio de Interferencia de Proteina
Metabolismo de Aspartato
Validacao de Alvos Terapeuticos

Resumo em português

A malaria e uma das infeccoes humanas mais prevalentes em todo o mundo, com mais de 40% da populacao mundial vivendo em areas endemicas. Na ausencia de uma vacina eficaz, o surgimento de cepas resistentes aos medicamentos existentes requer desenvolvimento urgente de novos medicamentos. Os metodos atuais aplicados a validacao de alvos terapeuticos, um passo crucial no desenvolvimento de farmacos, possuem varias limitacoes em malaria. O objetivo deste estudo foi avaliar se os desafios encontrados no processo de validacao de alvos antimalaricos podem ser abordados pela incorporacao de subunidades proteicas mutantes a complexos de proteínas oligomericas do organismo-alvo in vivo. Foram realizados experimentos com mutantes que, baseados em estruturas cristalograficas, poderiam interferir nas interacoes inter-oligomericas das enzimas aspartato aminotransferase (PfAspAT), malato desidrogenase (PfMDH) e aspartato transcarbamoilase (PfATC) de P. falciparum. O efeito dessas mutacoes na atividade enzimática foi avaliado por medicoes de atividade especifica. A capacidade das enzimas mutantes de formar um complexo com as suas respectivas formas selvagem foi avaliada por experimentos de coexpressao/ purificacao seguidas por analise por Western blot. O efeito na proliferacao foi avaliado pelo monitoramento do crescimento de parasitas cultivados em meio RPMI normal e com baixa concentracao de aspartato. Atraves do rompimento de interfaces oligomericas utilizando subunidades mutantes das enzimas alvo, demonstramos claramente uma reducao significativa na atividade enzimatica especifica in vitro e em ensaios whole cell. Alem disso, demonstramos o efeito fenotipico da introducao dessas subunidades mutantes diretamente no parasita, validando o metabolismo do aspartato de P. falciparum sem recorrer a abordagens geneticas complexas. Esses achados sugerem a possibilidade de validacao de outros componentes do metabolismo do aspartato plasmodial e demonstram que abordagem da PIA representa uma adicao valiosa ao painel de metodos de validacao atual.

Título em inglês

The Oligomeric Protein Interference Assay Method for Validation of Antimalarial Targets.

Palavras-chave em inglês

Aspartaatmetabolisme, validatie van geneesmiddeldoelen
Plasmodium falciparum
Protein Interference Assay

Resumo em inglês

Malaria is een van de meest voorkomende infecties bij mensen wereldwijd, waarbij meer dan 40% van de wereldbevolking in malaria-endemische gebieden woont. Bij afwezigheid van een effectief vaccin vereist de opkomst van geneesmiddelresistente stammen dringende ontwikkeling van geneesmiddelen. De huidige methoden die worden toegepast bij de validatie van het doelwit van geneesmiddelen, een cruciale stap bij het ontdekken van geneesmiddelen, hebben verschillende beperkingen bij malaria. Het doel van deze studie was om te evalueren of uitdagingen in het antimalaria-validatieproces kunnen worden aangepakt door mutante eiwitten in vivo in oligomere eiwitcomplexen van het doelorganisme op te nemen. We hebben structuurgebaseerde mutagene experimenten uitgevoerd die interfereren met de inter-oligomere interacties van de enzymen aspartaat aminotransferase (PfAspAT), malaat dehydrogenase (PfMDH) en aspartaat transcarbamoylase (PfATC) van P. falciparum. Het effect van deze mutaties op enzymactiviteit werd beoordeeld door specifieke metingen in vitro en in helecelassays. Het vermogen van de mutante enzymen om een complex te vormen met hun respectieve wildtype vormen werd geevalueerd door co-expressie/zuiveringsexperimenten gevolgd door western-blot-analyse. Het effect op proliferatie werd aangetoond door de groei van gekweekte parasieten in normale RPMI en aspartaat-beperkte media te volgen. Door oligomere raakvlakken te verstoren met behulp van mutante subeenheden van de doel-enzymen, hebben we een significante vermindering van enzymactiviteit in vitro en in vivo aangetoond. Bovendien hebben we een fenotypisch effect aangetoond van de introductie van deze mutante subeenheden in de parasiet, waarbij het aspartaatmetabolisme van P. falciparum als een geneeskrachtige Route werd gevalideerd complexe genetische benaderingen. Deze bevindingen bieden een mogelijkheid om componenten van het aspartaatmetabolisme verder te valideren als geneesmiddeldoelen en suggereren de PIA-benadering als een waardevolle aanvulling op de huidige validatietoolbox.

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Data de Liberação

2026-02-01

Data de Publicação

2024-02-05

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