O ensaio de interferência de proteínas oligoméricas como método de validação de alvos antimaláricos.

Batista, Fernando de Assis

doi:10.11606/T.42.2019.tde-02022024-183635

Início

Servicios

Tesis Doctoral

DOI

https://doi.org/10.11606/T.42.2019.tde-02022024-183635

Documento

Tesis Doctoral

Autor

Batista, Fernando de Assis (Catálogo USP)

Nombre completo

Fernando de Assis Batista

Instituto/Escuela/Facultad

Instituto de Ciências Biomédicas

Área de Conocimiento

Biología de la Interacciones Huésped-Patógeno

Fecha de Defensa

2019-12-09

Publicación

São Paulo, 2019

Director

Wrenger, Carsten (Catálogo USP)

Tribunal

Wrenger, Carsten (Presidente)
Lotufo, Leticia Veras Costa
Schmidt, Martina
Wunderlich, Gerhard

Título en portugués

O ensaio de interferência de proteínas oligoméricas como método de validação de alvos antimaláricos.

Palabras clave en portugués

Plasmodium falciparum
Ensaio de Interferencia de Proteina
Metabolismo de Aspartato
Validacao de Alvos Terapeuticos

Resumen en portugués

A malaria e uma das infeccoes humanas mais prevalentes em todo o mundo, com mais de 40% da populacao mundial vivendo em areas endemicas. Na ausencia de uma vacina eficaz, o surgimento de cepas resistentes aos medicamentos existentes requer desenvolvimento urgente de novos medicamentos. Os metodos atuais aplicados a validacao de alvos terapeuticos, um passo crucial no desenvolvimento de farmacos, possuem varias limitacoes em malaria. O objetivo deste estudo foi avaliar se os desafios encontrados no processo de validacao de alvos antimalaricos podem ser abordados pela incorporacao de subunidades proteicas mutantes a complexos de proteínas oligomericas do organismo-alvo in vivo. Foram realizados experimentos com mutantes que, baseados em estruturas cristalograficas, poderiam interferir nas interacoes inter-oligomericas das enzimas aspartato aminotransferase (PfAspAT), malato desidrogenase (PfMDH) e aspartato transcarbamoilase (PfATC) de P. falciparum. O efeito dessas mutacoes na atividade enzimática foi avaliado por medicoes de atividade especifica. A capacidade das enzimas mutantes de formar um complexo com as suas respectivas formas selvagem foi avaliada por experimentos de coexpressao/ purificacao seguidas por analise por Western blot. O efeito na proliferacao foi avaliado pelo monitoramento do crescimento de parasitas cultivados em meio RPMI normal e com baixa concentracao de aspartato. Atraves do rompimento de interfaces oligomericas utilizando subunidades mutantes das enzimas alvo, demonstramos claramente uma reducao significativa na atividade enzimatica especifica in vitro e em ensaios whole cell. Alem disso, demonstramos o efeito fenotipico da introducao dessas subunidades mutantes diretamente no parasita, validando o metabolismo do aspartato de P. falciparum sem recorrer a abordagens geneticas complexas. Esses achados sugerem a possibilidade de validacao de outros componentes do metabolismo do aspartato plasmodial e demonstram que abordagem da PIA representa uma adicao valiosa ao painel de metodos de validacao atual.

Título en inglés

The Oligomeric Protein Interference Assay Method for Validation of Antimalarial Targets.

Palabras clave en inglés

Aspartaatmetabolisme, validatie van geneesmiddeldoelen
Plasmodium falciparum
Protein Interference Assay

Resumen en inglés

Malaria is een van de meest voorkomende infecties bij mensen wereldwijd, waarbij meer dan 40% van de wereldbevolking in malaria-endemische gebieden woont. Bij afwezigheid van een effectief vaccin vereist de opkomst van geneesmiddelresistente stammen dringende ontwikkeling van geneesmiddelen. De huidige methoden die worden toegepast bij de validatie van het doelwit van geneesmiddelen, een cruciale stap bij het ontdekken van geneesmiddelen, hebben verschillende beperkingen bij malaria. Het doel van deze studie was om te evalueren of uitdagingen in het antimalaria-validatieproces kunnen worden aangepakt door mutante eiwitten in vivo in oligomere eiwitcomplexen van het doelorganisme op te nemen. We hebben structuurgebaseerde mutagene experimenten uitgevoerd die interfereren met de inter-oligomere interacties van de enzymen aspartaat aminotransferase (PfAspAT), malaat dehydrogenase (PfMDH) en aspartaat transcarbamoylase (PfATC) van P. falciparum. Het effect van deze mutaties op enzymactiviteit werd beoordeeld door specifieke metingen in vitro en in helecelassays. Het vermogen van de mutante enzymen om een complex te vormen met hun respectieve wildtype vormen werd geevalueerd door co-expressie/zuiveringsexperimenten gevolgd door western-blot-analyse. Het effect op proliferatie werd aangetoond door de groei van gekweekte parasieten in normale RPMI en aspartaat-beperkte media te volgen. Door oligomere raakvlakken te verstoren met behulp van mutante subeenheden van de doel-enzymen, hebben we een significante vermindering van enzymactiviteit in vitro en in vivo aangetoond. Bovendien hebben we een fenotypisch effect aangetoond van de introductie van deze mutante subeenheden in de parasiet, waarbij het aspartaatmetabolisme van P. falciparum als een geneeskrachtige Route werd gevalideerd complexe genetische benaderingen. Deze bevindingen bieden een mogelijkheid om componenten van het aspartaatmetabolisme verder te valideren als geneesmiddeldoelen en suggereren de PIA-benadering als een waardevolle aanvulling op de huidige validatietoolbox.

ADVERTENCIA - La consulta de este documento queda condicionada a la aceptación de las siguientes condiciones de uso:
Este documento es únicamente para usos privados enmarcados en actividades de investigación y docencia. No se autoriza su reproducción con finalidades de lucro. Esta reserva de derechos afecta tanto los datos del documento como a sus contenidos. En la utilización o cita de partes del documento es obligado indicar el nombre de la persona autora.

Fernando_Asdsis_Batista_DO_integral_parcial.pdf (392.37 Kbytes)

Ha ficheros retenidos debido al pedido (publicación de datos, patentes o derechos autorales).

Fecha de Liberación

2026-02-01

Fecha de Publicación

2024-02-05

Trabajos derivados

ADVERTENCIA: Aprenda que son los trabajos derivados haciendo clic aquí.