A amamentação é uma importante fonte alimentar na primeira infância e, considerando seu papel na regulação do crescimento e desenvolvimento da mucosa intestinal, o desmame precoce (DP) poderia promover alterações na proliferação e diferenciação celular com comprometimento da função intestinal. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar os marcadores relacionados ao processo de proliferação celular, diferenciação e fatores de crescimento do epitélio intestinal, observando os efeitos imediatos e tardios desencadeados pelo DP. No 15° dia de vida pós-natal, ratos Wistar foram submetidos ao DP, sendo separados de suas mães e mantidos em gaiola isolada, enquanto no grupo controle amamentado, os animais permaneceram com as mães até 21 dias. O intestino delgado foi coletado aos 18, 60 e 120 dias para avaliação de: expressão gênica e proteica; detecção e localização de moléculas para o estabelecimento do nicho de células tronco; efeitos epigenéticos a partir de genes diferencialmente expressos, e marcadores metabólicos. Dentre os parâmetros morfológicos, observamos que a altura das vilosidades foi significativamente diminuída pelo DP aos 18 e 60 dias, enquanto a profundidade da cripta não foi alterada pela alimentação, porém aumentou com o desenvolvimento. O índice proliferativo foi significativamente diminuído pelo DP aos 18 e 60 dias. A partir da contagem de células diferenciadas, verificamos que o número de enterócitos e de células caliciformes (vilo) diminuiu aos 18 dias; aos 60 dias somente o número de células caliciformes/vilo foi reduzido (DP), e aos 120 dias houve um aumento dessa população no eixo cripta-vilo, após o DP. Já a população de células de Paneth, presente somente na cripta, aumentou aos 18 e 60 dias. A partir da avaliação de genes-alvo para marcadores epiteliais, notamos que a expressão de sacarase, mucina 2 e defensina foi elevada pelo DP aos 18 dias, e de forma contrária, o gene Chga (célula enteroendócrina) e a expressão de lactase foram diminuídos pelo DP na mesma idade. Dentre os marcadores de fatores de crescimento, o DP causou a redução de Tgfb1 aos 18 dias, e de Egfr aos 60 dias. Destacamos que dentre os marcadores do ciclo celular, houve um aumento da Cdkn1b (p27) no DP em todas as idades avaliadas. Dentre os marcadores de células tronco, Lgr5 e Ascl2 tiveram redução aos 18 dias no DP, e aumento aos 60 dias, sendo que somente Ascl2 respondeu aos 120 dias, com diminuição após o DP. Avaliamos os marcadores das principais vias de sinalização na cripta e identificamos que Wnt3A, Notch 1 e Atoh 1 foram reduzidos pelo DP aos 18 dias, enquanto BMP2 aumentou na mesma idade. Aos 60 dias, verificamos um aumento em Wnt3A e Atoh 1, e redução da expressão de Notch 1, Notch 2 e BMP2. Nos animais de 120 dias somente nos níveis de Atoh1 aumentaram no DP. Em termos de níveis proteicos, Hes1 diminuiu nos animais DP aos 60 dias. As modificações epigenéticas foram estudadas também, sendo inconclusivas após o sequenciamento, porém observamos uma redução da expressão das enzimas Dnmt 3a e Dnmt 3b aos 18 dias no DP; aos 60 dias essa resposta foi detectada somente na Dnmt1, e aos 120 dias, a tanto Dnmt1 quanto Dnmt 3b diminuíram com o DP. Em termos de metabolismo, observamos que nos animais de 18 dias em DP ocorreu uma redução de glicemia sérica, e de forma contrária, aos 60 dias houve uma elevação significativa (teste de tolerância a glicose- GTT). Nossos resultados demonstraram que o desmame precoce comprometeu o processo de proliferação celular no intestino delgado, com efeitos sobre a expressão de genes-alvo marcadores do nicho de células tronco e de diferenciação celular, afetando as populações de enterócitos, células caliciforme e de Paneth, imediatamente após a interrupção do aleitamento, aos 18 dias. Vários efeitos foram mantidos até a idade adulta com modificação fenotípica e metabólica. Sugerimos que as respostas celulares ao DP podem ser duradouras e permanentes na mucosa intestinal, indicando que a amamentação regular é fundamental para o desenvolvimento do intestino delgado e sua manutenção na vida adulta.

Considering breastfeeding as an important food source during babyhood and its role in regulating the growth and development of intestinal mucosa, early weaning (EW) could promote changes in cell proliferation and differentiation processes, with impairment of intestinal function. Therefore, the aim of this study was to evaluate markers of cell proliferation, differentiation, and growth factors in the intestinal epithelium, observing the immediate and late effects triggered by EW. Wistar rats were submitted to EW at 15 postnatal days, when animals were isolated from their dams (control suckling group was weaned at 21 days). Jejunum samples were collected at 18, 60 and 120 d. We evaluated morphological parameters and their correlation with expression of genes and proteins related to growth, stem cell niche, signaling, epigenetic modification and metabolic markers. We observed that the villus height was significantly decreased at 18 and 60 days after EW, whereas the crypt depth was not affected by treatment, by grew throughout development. The proliferative index was significantly reduced at 18 and 60 days. After counting the differentiated cells, we found EW decreased the number of enterocytes and globlet cells (villi) at 18 days; at 60 days the distribution of goblet cells was reduced along villus, and at 120 days this population increased in the crypt-villus axis. Paneth cells, which are solely in the crypt, increased at 18 and 60 days in EW group. Among the target genes, the expression of sucrase, mucin 2 and defensin augmented at 18 days in EW and, conversely, Chga gene (enteroendocrine cells) and Lactase were reduced by EW at 18 days. From growth factor markers, EW triggered the decrease of Tgfb1 at 18 days, and of Egfr at 60 days. Interestingly, among cell cycle markers, Cdkn1b (p27) expression was higher in EW vs. control at all ages. From stem cell markers, Lgr5 and Ascl2 decreased at 18 days (EW) and augmented at 60 days. Of note, only Ascl2 was reduced by EW at 120 days. We studied the main signaling pathways in the crypt, and we found that after EW, Wnt3A, Notch 1 and Atoh1 showed a reduction at 18 days, whereas BMP2 increased at the same age. At 60 days, we found higher levels of Wnt3A and Atoh1 and a reduced expression of Notch 1, Notch 2 and BMP2. As for protein levels, EW decreased Hes1 at 60 days. Epigenetic changes were inconclusive, but wer detected decreased expression of Dnmt 3a and Dnmt 3b enzymes at 18 days in EW. At 60 days these changes were seen only in Dnmt1 and at 120 days the Dnmt1 and Dnmt3b were reduced in EW. In terms of metabolism, we observed that EW triggered a reduction of serum glycemia at 18 days, and conversely, at 60 days, there was a significant increase after (glucose tolerance test -GTT). Our results demonstrated that early weaning influenced cell proliferation in the small intestine, affecting the expression of target genes in the stem cell niche, and cell differentiation, changing enterocyte, globlet and Paneth cell populations immediately after breastfeeding interruption at 18 days. Part of the effects were maintained into adulthood with phenotypic and metabolic modifications. We suggest that cellular responses to EW can be permanent in the intestinal mucosa, indicating that breastfeeding is essential to the development of small intestine and its maintenance in adult life.