A membrana epirretiniana é um tecido fibrocontrátil que se forma na superfície interna da retina, podendo causar desde uma deficiência visual até o descolamento da retina. As células gliais de Müller participam ativamente da formação desta membrana. Atualmente, há uma busca por novas abordagens terapêuticas que visam prevenir ou tratar as disfunções celulares envolvidas na progressão desta fibrose. A via de sinalização das GTPases Rho está envolvida na regulação de vários processos celulares que podem ser associados à membrana, como proliferação, migração e contração celulares. Em especial, a enzima Rho quinase (ROCK), efetora da GTPase RhoA, é um potencial alvo terapêutico a ser investigado. Este estudo tem como principais objetivos avaliar, em células de Müller humanas, os efeitos de um inibidor de ROCK (Y27632) sobre a viabilidade, crescimento, organização do citoesqueleto, expressão de componentes da matriz extracelular, diferenciação em miofibroblastos, migração e contratilidade. Para isso, células da linhagem MIO-M1 foram cultivadas e tratadas por diferentes períodos com o inibidor. A viabilidade foi avaliada por ensaio com 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide (MTT) e pelo método de exclusão com azul de tripan. O crescimento foi avaliado por curva de crescimento e por ensaio de incorporação de BrdU. O citoesqueleto de actina foi evidenciado com faloidina fluorescente, enquanto filamentos intermediários e microtúbulos foram avaliados por imunofluorescência para vimentina e -tubulina. A expressão gênica e proteica de colágenos I e V, laminina e fibronectina foi avaliada por rt-PCR e imunofluorescência. A migração celular direcionada e espontânea foi estudada por ensaio em câmara bipartite e por observação de células vivas em microscopia de contraste de fase, respectivamente. A contratilidade celular foi avaliada por ensaio de contração em gel de colágeno. Os resultados mostraram que a inibição de ROCK com Y27632 não alterou a viabilidade e diminuiu o crescimento e a proliferação celular após 72 h. Houve alteração da morfologia celular e da organização da actina filamentosa (F-actina), com redução do corpo celular, desaparecimento de fibras de estresse e formação de prolongamentos celulares longos e ramificados. O citoesqueleto de microtúbulos e filamentos intermediários também foi alterado, possivelmente como consequência de alterações da F-actina. O inibidor também reduziu a expressão gênica e imunorreatividade de -actina de músculo liso, um marcador de miofibroblastos. A expressão de componentes da matriz extracelular não foi afetada pelo inibidor. A migração celular direcionada também não foi alterada, embora a contratilidade celular tenha sido substancialmente reduzida. Não foi observada migração espontânea de células MIO-M1. Em conclusão, a inibição farmacológica de ROCK em células de Müller sugere que esta pode ser uma abordagem potencial interessante no tratamento de membranas epirretinianas, prevenindo a proliferação, contratilidade e transdiferenciação dessas células, sem alterar a viabilidade celular.

The epiretinal membrane is a fibrocontractile tissue that forms on the inner surface of the retina, causing from visual impairment to retinal detachment. Müller glial cells actively participate in the formation of this membrane. Current research seeks new therapeutic approaches that aim to prevent or treat cellular dysfunctions involved in the progression of this common fibrosis. The Rho GTPases signaling pathway regulates several processes associated with the epiretinal membrane, such as cell proliferation, migration and contraction. Rho kinase (ROCK) in particular, an effector of the RhoA GTPase, is an interesting potential therapeutic target. This study aimed to evaluate, in human Müller cells, the effects of a ROCK inhibitor (Y27632) on cell viability, growth, cytoskeletal organization, expression of extracellular matrix components, myofibroblast differentiation, migration and contractility. Müller cells of the MIO-M1 lineage were cultured and treated for different periods with the inhibitor. Viability was evaluated by 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide (MTT) assay and trypan blue exclusion method. Growth was evaluated by growth curve and BrdU incorporation assay. The actin cytoskeleton was stained with fluorescent phalloidin, while intermediate filaments and microtubules were stained by immunofluorescence for vimentin and -tubulin. Gene and protein expression of collagens I and V, laminin and fibronectin were evaluated by rt-PCR and immunofluorescence. Chemotactic and spontaneous cell migration were studied by transwell assay and time-lapse observation of live cells, respectively. Cell contractility was assessed by collagen gel contraction assay. The results showed that ROCK inhibition by Y27632 did not affect cell viability and decreased cell growth and proliferation after 72 h. There was a change in cell morphology and organization of filamentous actin (F-actin), with a reduction in the cell body, disappearance of stress fibers and formation of long, branched cell extensions. The cytoskeleton of microtubules and intermediate filaments was also affected, possibly as a consequence of F-actin alterations. The inhibitor also reduced gene expression and immunoreactivity of smooth muscle -actin, a marker of myofibroblasts. The expression of extracellular matrix components was not affected by the inhibitor. Directed (chemotactic) cell migration was also unchanged, although cell contractility was substantially reduced. No spontaneous migration of MIO-M1 cells was observed. In conclusion, pharmacological inhibition of ROCK in Müller cells may be a potentially interesting approach to treat epiretinal membranes, preventing cell proliferation, contractility and transdifferentiation, without effects on cell viability.