Doctoral Thesis
DOI
https://doi.org/10.11606/T.42.2023.tde-22082023-161002
Document
Author
Full name
Cecília Gallottini de Magalhães
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2023
Supervisor
Committee
Yan, Chao Yun Irene (President)
Azambujá, Ana Paula
Cella, Nathalie
Porcionatto, Marimelia Aparecida
Title in Portuguese
Sinalização BMP e modulação da matriz extracelular durante a embriogênese óptica
Keywords in Portuguese
BMP
Desenvolvimento embrionário
Matriz exrtacelular
Placóide da lente
Single-cell RNAseq
Abstract in Portuguese
O desenvolvimento da lente é um modelo experimental clássico de morfogênese. A primeira evidência morfogênica da formação da lente é o placóide que surge pelo crescimento apical-basal da ectoderme cefálica em contato com a vesícula óptica. O processo de espessamento converte o epitélioo cuboidal em pseudoestratificado e ocorre apenas na região óptica, enquanto o ectoderma não placoidal circundante permanece cuboidal. A matriz extracelular (MEC) desempenha um papel importante na regulação dos processos morfogenéticos. No desenvolvimento inicial dos olhos, a Fibronectina é essencial para a formação do placóide da lente em camundongos. Nossos resultados anteriores mostram que a MEC entre a vesícula óptica e o placóide da lente evolui durante o espessamento do placóide. O padrão de marcação de Fibronectina e Laminina α1 muda na transição do epitélio cuboidal para o espesso. Antes do espessamento placoidal, a Fibronectina e a Laminina α1 exibem um padrão fibrilar homogêneo em todo o ectoderma cefálico, incluindo a região óptica. Durante o espessamento placoidal, a MEC torna-se difusa apenas na região óptica. Na região extra-placoidal, os componentes da MEC exibem um padrão fibrilar. Hipotetizamos que a MEC evolui junto com as mudanças da forma celular no placóide e sofre rearranjos restritos à região óptica. Como as células e a MEC mantêm uma relação dinâmica de interdependência e modulação, hipotetizamos que a MEC evolui juntamente com as mudanças de formato celular durante a diferenciação do placóide da lente e sofre rearranjos restritos à região óptica. Assim, nosso primeiro objetivo foi investigar se a evolução da MEC óptica depende da sinalização de BMP. A sinalização de BMP é necessária para a formação do placóide. Sem sinalização BMP na região óptica, a formação do placóide não ocorre e o desenvolvimento óptico é interrompido. Inibimos separadamente a sinalização BMP no ectoderma placodal e na vesícula óptica por meio da superexpressão de uma forma dominante negativa do receptor de BMP. Nossos resultados mostraram que a formação do placóide da lente e a evolução da MEC dependem da sinalização BMP no ectoderma placoidal, mas não na vesícula óptica. Nossos resultados mostraram que a formação do placóide do cristalino e a evolução da MEC dependem da sinalização de BMP no ectoderma placoidal, mas não da sinalização de BMP na vesícula óptica. Nosso segundo objetivo foi investigar quais fatores da MEC poderiam estar envolvidos à remodelação da MEC óptica. Para isso, analisamos genes associados à MEC expressos especificamente pelo placóide da lente e a investigamos a atividade proteolítica no tecido óptico. Esses dois processos envolvem importantes mecanismos de remodelação da MEC: deposição diferencial da MEC e a sua degradação. Para isso, realizamos análises in silico de dados publicados de scRNAseq e Microarray. Nós identificamos diversos genes da MEC transcritos por células do placóide da lente, mas não por células da vesícula óptica. Este resultado sugere que o placóide é responsável pela regulação da MEC óptica. Em seguida, examinamos a atividade da metaloproteinases (MMPs) por meio de zimografia in situ e analisamos a expressão de Timp2, um inibidor de MMP. O ensaio de zimografia in situ sugeriu que a atividade de MMPs é inibida na região óptica durante o espessamento do placóide da lente, no memso estágio em que ocorre um aumento na expressão de Timp2 especificamente nas células do placóide da lente. Além disso, observamos a presença significativa de Adamts18 (uma desintegrina e metaloproteinase com motivos de trombospondina) especificamente na porção basal do placóide durante seu espessamento. Esses resultados sugerem que a atividade de protease é modulada de maneira específica na região do placóide da lente durante sua formação. Além disso, a inibição da sinalização BMP manteve a atividade da protease e diminuiu a expressão de Timp2 na região óptica. Esses resultados mostram que a expressão de Timp2 e a inibição das proteases dependem da sinalização BMP e da diferenciação do placóide da lente. Com isso, propomos que o placóide da lente desempenha um papel ativo na remodelação da matriz extracelular óptica.
Title in English
BMP signaling and modulation of the extracellular matrix during optical embryogenesis
Keywords in English
BMP
Embryo development
Extracellular matrix
Lens placode
Single-cell RNAseq
Abstract in English
Lens development is a classic morphogenesis experimental model. The first morphogenic evidence of the lens formation is the placode. It appears through apical-basal growth of the single cuboidal epithelial layer (ectoderm) when it contacts the underlying optic vesicle. The thickening process converts the epithelium from cuboidal to pseudostratified and it happens only in the optic region, while the surrounding non-placodal ectoderm remains cuboidal. Extracellular matrix (ECM) plays a major role in regulating morphogenetic processes. In eye development, Fibronectin is essential for lens placode formation in mice. Our previous results show that the ECM between the optic vesicle and lens placode evolves during placode formation. Fibronectin and Lamininα1 labeling pattern changed in the transition from cuboidal to thick epithelium. Prior to placodal thickening, Fibronectin and Lamininα1 display a homogeneous fibrillar pattern throughout the cephalic ectoderm and optic region. During placodal thickening, ECM becomes diffuse only in the placodal region. In the extra-placodal region, ECM components display a fibrillar pattern. Since cells and ECM have a dynamic relationship of interdependence and modulation, we hypothesized that more components of the ECM evolve together with the cell shape changes during lens placode differentiation and undergo rearrangements restricted to the optic region. Thus, our first aim was to investigate if the optic ECM evolution depends on BMP signaling. BMP signaling is another necessary factor for lens formation. Without BMP signaling in the optic region, placode formation does not occur and eye development is interrupted. We inhibited BMP signaling separately in the placode ectoderm and in the optic vesicle through the overexpression of a dominant negative form of BMP receptor. Our results showed that lens placode formation and ECM evolution depends on BMP signaling in the placodal ectoderm but not on BMP signaling in the optic vesicle. Together, our results suggest that evolution of optic ECM architecture and composition depends on the lens placode ectodermal cells. Our second goal was to investigate which ECM factors could be involved in optic ECM remodelling. For this, we analyzed ECM associated genes specifically expressed by the lens placode and protease activity in the optic tissue. These two process drive important mechanisms of ECM remodelling: differential ECM deposition and ECM degradation. Thus, we performed in silico analyses of publicly available scRNAseq and microarray data. We identified several ECM genes transcribed by lens placodal cells but not by optic vesicle cells. This result suggests that the placode is modulates the optic ECM actively. Next, we examined extracellular protease activity through in situ zymography and analyzed the expression of Timp2, a metalloprotease (MMP) inhibitor. The in situ zymography assay suggested that protease activity is downregulated in the optic region during lens placode thickening, concurrently with Timp2 expression increase specifically in the lens placode. In addition, we observed a significant presence of Adamts18 (a desintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs) specifically in the basal portion of the placode during its thickening. These results suggest that protease activity is specifically modulated in the lens placode region during its formation. Furthermore, inhibition of BMP signaling maintained protease activity in the optic ECM and decreased Timp2 expression decreased in the optic region. These results suggest that Timp2 expression and protease inhibition depend on BMP signaling and lens placode differentiation. With that, we propose that the lens placode plays an active role in remodeling the optic ECM.
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Release Date
2025-08-21
Publishing Date
2023-08-23