A espermatogênese em peixes é regulada tanto pelas gonadotropinas Lh (hormônio luteinizante) e Fsh (hormônio folículo estimulante) (regulação endócrina), como, também, por fatores de crescimento (regulação parácrina). Dentre os fatores regulados pelo Fsh, está o hormônio Anti-Mülleriano (Amh), uma glicoproteína pertencente à família Fator de Crescimento Transformante do tipo Beta (TGFα6), secretado pelas células de Sertoli e que em algumas espécies está envolvido com a inibição da diferenciação espermatogonial. Para esclarecer a regulação endócrina e parácrina do nicho espermatogonial em espécies nativas, foi utilizado como espécie modelo o Characiforme Astyanax altiparanae, o qual tem sido considerado uma espécie modelo neotropical e de grande importância para aquicultura brasileira e com potenciais econômicos e ecológicos. Foi realizado o isolamento e caracterização molecular do cDNA para o Amh por meio de RT-PCR e RACE-PCR, o qual apresentou 2738 pares de bases (pb) de extensão e open reading frame (ORF) de 1629 pb. Apresenta, ainda, 5 UTR com 72 pb, 3 UTR com 1014 pb e cauda poli-A de 23 bases. A dedução desta sequência em aminoácidos resulta em uma proteína de 543 aminoácidos. De acordo com análise da árvore filogenética, o Amh de A. altiparanae apresentou forte relação com outras espécies de peixes ósseos, especialmente das ordens Characiformes, Cypriniformes, Cichliformes e Perciformes. Foi avaliada a possível alteração de expressão gênica de amh ao longo do ciclo reprodutivo de A. altiparanae em cativeiro e, os dados demonstraram que há diferença estatística quando comparamos as estações de verão com a de outono e, também, quando comparamos a de outono com a de inverno. Por meio de qPCR também foi avaliada a expressão de amh em diferentes órgãos e tecidos de machos e fêmeas de A. altiparanae e, embora haja níveis de transcritos nos órgãos como coração, músculo e cérebro de ambos os sexos, os testículos apresentaram níveis maiores de transcritos de amh. A localização celular específica de Amh foi analisada por meio das técnicas de imuno-histoquímica por peroxidase e imunoflorescência, utilizando-se o anticorpo policlonal anti-Amh produzido a partir da sequência previamente clonada. Em ambas as técnicas houve imunomarcações em células de Sertoli, as quais envolviam tanto espermatogônias indiferenciadas (A_und), quanto espermatogônias diferenciadas do tipo A (A_diff). O sinal tornava-se fraco ou ausente em células germinativas mais tardias como espermatogônias do tipo B, espermatócitos e espermátides. Por fim, foi realizada cultura de tecido com o objetivo de avaliar a liberação de andrógeno 11-cetotestosterona (11-KT) sob influência de Fsh e Lh, visto que este hormônio também está relacionado com a regulação da espermatogênese e expressão de Amh. Embora o Fsh tenha sido caracterizado como principal hormônio regulador de 11-KT, o Lh se mostrou mais efetivo. Os resultados obtidos trarão melhor compreensão da biologia reprodutiva de A. altiparanae, bem como da homeostase da espermatogênese. Além disso, os resultados sobre a regulação do nicho espermatogonial por meio do Amh, darão subsídios em como estes aspectos podem influenciar a autorrenovação e diferenciação das espermatogônias indiferenciadas, possíveis candidatas às espermatogônias-tronco.

Spermatogenesis in fish is regulated by the gonadotropins Lh (luteinizing hormone) and Fsh (follicle-stimulating hormone) (endocrine regulation), as by growth factors (paracrine regulation). Anti-Müllerian Hormone (Amh), a glycoprotein belonging to the Transforming Growth Factor Beta (TGFβ) family, secreted by Sertoli cells and which in some species is involved in the inhibition of spermatogonial differentiation.To clarify the endocrine and paracrine regulation of the spermatogonial niche in native species, the Characiforme Astyanax altiparanae was used as a model species, which has been considered a neotropical experimental species and of great importance for Brazilian aquaculture with economic and ecological potential. The isolation and molecular characterization of Amh cDNA were performed by RT-PCR and RACE-PCR, encompassing 2738 base pairs (bp) in length and a 1629 bp open reading frame (ORF). It also features a 72 bp 5 UTR, a 1014 bp 3 UTR and a 23-base poly-A tail. The deduction of this sequence into amino acids results in a protein 543 amino acids. According to phylogenetic analysis, the Amh of A. altiparanae showed a strong relationship with other fish species, especially from the orders Characiformes, Cypriniformes, Cichliformes and Perciformes. The possible alteration of amh gene expression during the reproductive cycle of A. altiparanae in captivity was evaluated, and the data statistical difference when comparing the summer and autumn seasons, and when comparing the autumn with winter also. Using qPCR, the expression of amh was also evaluated in different organs and tissues males and females of A. altiparanae and, although transcripts levels were found in organs such as heart, muscle and brain of both sexes, the testes showed higher levels of transcripts from amh. The specific cell localization of Amh was analyzed by peroxidase immunohistochemistry and immunofluorescence techniques, using a anti-Amh polyclonal antibody produced from the previously cloned sequence. Immunostaining in Sertoli cells involving both undifferentiated spermatogonia (A_und) and differentiated type A spermatogonia (A_diff) was detected in both techniques. Staining faded and disappeared in later germ cells such as type B spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. Finally, tissue culture was performed in order to evaluate the release of androgen 11-ketotestosterone (11-KT) under the influence of Fsh and Lh, since this hormone is also related to the regulation of spermatogenesis and Amh expression. Although Fsh has been characterized as the main 11-KT regulatory hormone, Lh was shown here to be more effective. The results obtained will bring a better understanding of the reproductive biology of A. altiparanae, as well as the spermatogenesis homeostasis. In addition, the results on the regulation of the spermatogonial niche through Amh will support how these aspects can influence self-renewal and differentiation of undifferentiated spermatogonia, possible candidates for stem cell spermatogonia.