O fator de transcrição T-box2 (TBX2) é altamente expresso em tecidos fetais humanos pulmonares e possui um papel importante na organogênese dos pulmões. A superexpressão de TBX2 foi observada em diferentes tipos de câncer, promovendo proliferação, resistência a quimioterápicos, migração e invasão de células tumorais. O papel de TBX2 no câncer de pulmão, entretanto, ainda não é bem compreendido. Nesse estudo foi investigado o efeito do knockdown de TBX2 na proliferação, morfologia e formação de esferoides, da linhagem A549 de adenocarcinoma. O knockdown de TBX2 foi feito usando um plasmídeo de expressão shRNA alvo-específico. A proliferação das células com o knockdown e controles foi avaliada através dos ensaios de viabilidade celular, ciclo celular e índice mitótico. A formação de culturas 3D foi avaliada usando microscopia de luz, de contraste de fase, de fluorescência e eletrônica. Os resultados do ensaio de viabilidade celular, ciclo celular e índice mitótico não mostraram diferenças relevantes entre A549shTBX2 e os controles (A549 e A549shControl). Ocorreu um discreto aumento de células viáveis (2%), de células na fase S (5%) e do índice mitótico (3%) das células de A549shTBX2 em relação aos controles. Quanto à formação de esferoides, as micrografias de contraste de fase evidenciaram a incapacidade das células com knockdown de TBX2 de formar esferoides em relação aos controles, exibindo agregados celulares pouco compactos que se desagregaram já no 7°dia em cultura. Foi feito ensaio de ciclo celular dos esferoides que mostrou um aumento notável do percentual de células em SubG0 de A549shTBX2 (26,02%) em relação aos controles, A549 (4,69%) e A549shControl (6,41%), ocorrendo concomitantemente diminuição do percentual de células nas fases S, G1 e G2/M do ciclo. Esses resultados foram confirmados pelas imagens de microscopia eletrônica, as quais mostraram a presença de células apoptóticas, necroptóticas, completa ausência de interações intracelulares e células com estresse do retículo endoplasmático. Indicando que o knockdown de TBX2 diminui a resistência à anoikis, provavelmente à causa do aumento da expressão de E-caderina, cujo gene é um alvo de repressão transcricional bem conhecido de TBX2.

T-box2 transcriptional factor (TBX2) is highly express in fetal lung tissue and has an importante role in lung organogenesis. Overexpression of TBX2 was observed in different types of cancer, promoting proliferation, chemotherapy resistence, migration and invasion of tumor cells. However, the role of TBX2 in lung cancer is still unclear. In this study the effect of TBX2 negative regulation, in proliferation, morphology and spheroid formation, in A549 adenocarcinoma cells was investigated.The knockdown of TBX2 was obtain using a shRNA expression plasmid targeting TBX2 transcripts. Proliferation of knockdown cells and controls was evaluated trough celular viability, cell cycle and mitotic index assay. Spheroid formation was assessed by light, phase contrast, fluorescence and trasnmission electron microscopy. Cellular viability, cell cycle and mitotic index assay didnt show significant diferences amongst A549shTBX2 and controls. A459shTBX2 cells presented a slight increase in viable cells (2%), cells in S phase (5%) and mitotic index (3%) compared to controls. Phase contrast images showed cell aggregates formation that did not displayed a condensed organization, and on the 7_th day the aggregates dissociated completly. Cell cycle analysis of spheroids (controls) and aggregates revealed a substantial increase in SubG0 cell population (26.02%) in A549shTBX2 aggregates, compared to controls, A549 (4.69%) e A549shControl (6,41%), with decrease of S, G1, G2/M cell population. These results were confirm by TEM images, that revealed apoptotic and necroptotic cells, abscence of intercellular interactions and cells with endoplasmic reticulum stress. Suggesting that knockdown of TBX2 decreased anoikis resistance in NSCLC cells, probably due to the increased E-cadherin expression., a well known TBX2 transcriptional repression target.