A integração entre movimentos morfogenéticos e redes de regulação gênica durante o desenvolvimento embrionário é responsável pelo correto desenvolvimento cardíaco. Neste processo, padrões espaço-temporais da expressão gênica levam à transformação do tubo cardíaco primitivo num coração formado por quatro câmaras. Pouco se sabe a respeito de como esses eventos acontecem a nível molecular. Foi demonstrado que o gene SMyHC III apresenta dualidade na expressão durante o desenvolvimento cardíaco. Nos estágios iniciais, é expresso ao longo de todo o tubo cardíaco, enquanto na etapa da especificação das câmaras (átrio e ventrículo), sua expressão passa a ser átrio-específica. Postulou-se que um elemento de resposta à vitamina D e ao ácido retinoico (VDRE/RARE), presente na sequência do promotor do gene SMyHC III era responsável pela repressão da atividade ventricular, mas a sequência responsável por sua especificidade atrial carecia de elucidação. A fim de compreender este processo, nosso grupo de pesquisa descreveu o elemento complexo de receptores nucleares (cNRE), um novo sítio regulatório, de 32 pares de base e estruturalmente formado por três héxades (A, B e C) que contém sítios de ligação de receptores nucleares presente no promotor. Em face destas evidências, neste trabalho testamos a hipótese de que cNRE é responsável pela ativação átrio-específica do promotor de SMyHC III, além de propor o mecanismo molecular que, através do cNRE, regula esta atividade. Inicialmente, para validar a hipótese, foram realizados experimentos de transgenia em zebrafish, onde demonstramos que o promotor SMyHC III (contendo o cNRE) dirigiu a expressão de GFP de modo preferencial em átrios e transformou o padrão de atividade de um promotor ventricular (vmhc) numa direção atrial, demonstrando que o cNRE é um elemento necessário à ativação atrial do promotor, além de cruzar a barreira de espécie. A próxima etapa foi verificar se o regulador do destino atrial COUPTF-II (do inglês, Chicken Ovalbumin Upstream Promoter Transcription Factor II), poderia ativar o promotor SMyHC III via cNRE e, apesar de COUPTF-II interagir com o promotor numa região que contêm o cNRE, observamos que a ligação de COUPTF-II reprimiu a atividade do promotor. Assim, utilizamos espectrometria de massas como estratégia para identificação de coativadores de COUPTF-II e identificamos o receptor de andrógeno (AR). De modo análogo ao COUPTF-II, AR age como repressor do promotor SMyHC III. No entanto, observamos que a interação sinérgica entre COUPTF-II e AR ativa promotor SMyHC III de forma dependente do cNRE. Em síntese, neste trabalho evidenciamos que cNRE, presente na sequência do promotor SMyHC III, contêm a informação necessária para sua atividade átrio-específica, bem como para sua repressão ventricular. Também demonstramos que este elemento é sítio de ligação para COUPTF-II que, numa interação sinérgica com AR ativa o promotor via cNRE, revelando uma nova função para AR que não havia sido reportada na literatura. Adicionalmente, verificamos que a ativação do promotor de SMyHC III mediada por cNRE se dá por um mecanismo universal que cruza a barreira de espécies.

The interplay between morphogenetic movements and gene regulatory networks taking place during embryonic development is responsible for proper heart development. In this process, spatial gene expression patterns lead to the development of the primary heart tube into a complex four-chamber organ. However, little is known about how these events are regulated at the molecular level. For instance, it has been evidenced that the SMyHC III gene has a dual pattern of expression during heart development. In the early stages, it is expressed throughout the entire heart tube and then, upon chamber specification, its expression is restricted to atria. It has been postulated that a Vitamin D/Retinoic Acid Responsive Element (VDRE/RARE), present at the SMyHC III promoter is in charge of its ventricular repression. However, the element driving its atrial expression remains elusive. As a means to fill this gap, our research group previously established that the SMyHC III gene promoter carries the complex Nuclear Receptor Element (cNRE), a new 32-bp regulatory element that is composed of three tandem-arrayed hexads, harboring binding sites for multiple transcription factors. Here, we hypothesized that cNRE is responsible for the atria-specific activation of the SMyHC III promoter, and the molecular mechanism regulating this characteristic. Transgenesis assays performed in zebrafish with the SMyHC III promoter driving GFP expression revealed that cNRE is necessary for atrial GFP expression and sufficient to switch the ventricular specific promoter (vmhc) towards an atrial direction. Thus, not only cNRE drives atrial specification of gene expression, it crosses the species barrier. Next, we tested whether the master regulator of atrial identity COUPTF-II (Chicken Ovalbumin Upstream Promoter Transcription Factor II), would activate the SMyHC III promoter via cNRE. We found that COUPTF-II binds a promoter fragment that harbors the cNRE. Unexpectedly, transactivation assays showed that COUPTF-II represses SMyHC III promoter activation. We then employed a Mass Spectrometry-based strategy and identified the Androgen Receptor (AR) as a new COUPTF-II ligand. AR was also found to be a repressor of the SMyHC III promoter, but in synergic interaction with COUTF-II, it activated the promoter in a cNRE-dependent manner. In synthesis, in this thesis, we validated a new gene regulatory sequence (cNRE) that is responsible for the atrial activation of the SMyHC III promoter, as well as for the repression of the same promoter in the ventricular context. We also showed that this element has a binding site for COUTF-II that, synergically with AR activates SMyHC III promoter via cNRE. Taken together, these findings point out to a new complex nuclear receptor element (cNRE) carrying species barrier-crossing information to provide chamber-specific gene expression and unveil new roles for known transcription factors in cell fate and cardiac chamber specification.