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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.42.2020.tde-16072020-154124
Documento
Autor
Nome completo
Angelo Gustavo Di Stefano
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2020
Orientador
Banca examinadora
Ortis, Fernanda (Presidente)
Debbio, Carolina Beltrame Del
Gomes, Patricia Rodrigues Lourenço
Monaco, Camila Ferraz Lucena
Título em português
O papel do HNF4 na morte das células beta pancreáticas induzida por citocinas pró-inflamatórias.
Palavras-chave em português
Célula beta pancreática
Diabetes mellitus
Hepato-cyte nuclear factor 4 alpha
Morte celular
Resumo em português
O diabetes mellitus tipo 1 (DM1) é uma doença autoimune que causa a disfunção e a destruição das células β pancreáticas, produtoras de insulina, ao induzir vias pró-apo-ptóticas, como o estresse de retículo endoplasmático (RE), devido a exposição dessas células à citocinas pró-inflamatórias. O Mature-onset diabetes of the youth type 1 (MODY1) é um tipo de DM causado por mutações no gene Hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4 α ), levando a deficiência na secreção de insulina. Além de outras diversas funções na diferenciação e da sobrevivência das células β, esse gene também é importante para a manutenção da homeostase do RE, sugerindo que o papel do HNF4 α na regulação da secreção de insulina poderia estar relacionado a viabilidade das células β frente a exposição à citocinas pró-inflamatórias. Sendo assim, o estudo visou avaliar o papel desse gene na disfunção e morte de células β após exposição destas às citocinas pró-inflamatórias. Foi realizado o silenciamento do HNF4 α em células de insulinoma de rato (INS-1E) com siRNA seguido de tratamento com citocinas pró-inflamatórias (IL-1 β + IFN- + TNF) ou tapsigargina (indutor de estresse de RE) para avaliação da ativação da Caspase-3 e das proteínas de estresse de RE (p-eIF2 α , p-IRE1 e XBP1s) por western blot. Para avaliar o efeito do HNF4α no metabolismo da glicose, foi realizado o Teste de Tolerância a Glicose (GTT) em camundongos da linhagem InsCRE.HNF4 α loxP/loxP, após a indução do knockout. Em seguida, foi avaliado por western blot a expressão de Caspase-3 nas ilhotas dos camundongos knockout após exposição aos mesmos tratamentos que as células INS-1E. Também foi avaliada a expressão de insulina e glucagon nessas ilhotas através de imunohistoquímica. A redução da expressão do HNF4 α protegeu contra morte por apoptose, pois diminui a expressão de Caspase-3 ativada nas células INS-1E e nas ilhotas knockout. Além disso, houve a redução da expressão das proteínas relacionadas ao estresse de RE nas células INS-1E. Animais HNF4 α knockout apresentam tolerância diminuída a glicose. As ilhotas knockout apresentaram significativa redução na marcação de insulina. Como um todo, esses resultados mostram que o HNF4 α parece ter uma participação 11 deletéria em células β expostas à citocinas pró-inflamatórias, porém exerce um importante papel na função fisiológica dessas células. Frente a esses resultados, sugere-se um importante papel do HNF4 α na manutenção do estado diferenciado das células β, pois, devido à perda desse estado diferenciado, pela redução da expressão desse fator de transcrição, essas células param de responder às citocinas pró-inflamatórias como esperado de uma célula β normal. Sendo assim, um melhor entendimento das vias reguladas pelo HNF4 α em células β é de extrema importância para o desenvolvimento de terapias de prevenção da função e viabilidade dessas células.
Título em inglês
Hole of HNF4 α in cell death of pancreatic beta cell induced by proinflammatory cytokines.
Palavras-chave em inglês
Cell death
Diabetes mellitus
Hepatocyte nuclear factor 4 alpha
Pancreatic beta cell
Resumo em inglês
Type 1 diabetes mellitus (DM1) is an autoimmune disease that causes dysfunction and destruction of insulin-producing pancreatic β cells by inducing pro-apoptotic pathways such as endoplasmic reticulum (ER) stress due to exposition to proinflammatory cyto-kines. Mature-onset diabetes of the youth type 1 (MODY1) is a type of DM caused by mutations in the Hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4 α) gene, leading to deficiency in insulin secretion. Besides several other functions in the differentiation and survival of β cells, this gene is also important for the maintenance of ER homeostasis, suggest-ing that the role of HNF4 α regulating insulin secretion could be related to β cell viability exposed to proinflammatory cytokines. Thus, this study aimed to evaluate the role of this gene in dysfunction and death of β cells after exposure to proinflammatory cyto-kines. The expression of HNF4 α was reduced in rat insulinoma cells (INS-1E) with siRNA followed by treatment with proinflammatory cytokines (IL-1 β + IFN- + TNF) or thapsigargin (ER stress inducer) to evaluate activation of Caspase-3 and expression of ER stress proteins (p-eIF2 α, p-IRE1 and XBP1s) by western blot. To evaluate the effect of HNF4 α on glucose metabolism, the Glucose Tolerance Test (GTT) was per-formed on InsCRE.HNF4 αloxP / loxP mice after knockout induction. Then, expression of Caspase-3 in islets of knockout mice by western blot was evaluated after exposure to the same treatments as INS-1E cells. The expression of insulin and glucagon in these islets was also evaluated by immunohistochemistry. Reduced HNF4 α expression pro-tected against death by apoptosis decreasing activated Caspase-3 in INS-1E cells and knockout islets. In addition, there was a reduced expression of ER stress-related pro-teins in INS-1E cells. Animals HNF4 α knockout exhibit decreased glucose tolerance. Knockout islets showed significant reduction in insulin labeling. Overall, these results show that HNF4 α appears to have a deleterious effect on β cells exposed to proinflam-matory cytokines, but have an important role in the physiological function of these cells. Given these results, it is suggested an important role of HNF4 α in maintaining the dif-ferentiated state of β cells, because, due to the loss of this differentiated state, by 13 reducing the expression of this transcription factor, these cells stop responding to pro-inflammatory cytokines as expected from a normal β cell. Thus, a better understanding of the pathways regulated by HNF4 α in β cells is extremely important for the develop-ment of therapies to maintain the function and viability of these cells.
 
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Data de Liberação
2022-07-16
Data de Publicação
2021-10-14
 
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