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Mémoire de Maîtrise
DOI
https://doi.org/10.11606/D.42.2021.tde-15122022-100429
Document
Auteur
Nom complet
Daniel Casartelli de Santa Inez
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2021
Directeur
Jury
Kimura, Edna Teruko (Président)
Freitas, Vanessa Morais
Rubio, Ileana Gabriela Sanchez de
Silva, Carolina Ferraz da
 
Titre en portugais
Efeito da edição gênica e modulação da expressão de MIR146B no câncer de tiroide.
Mots-clés en portugais
Câncer anaplásico de tiroide
CRISPR/Cas
Edição gênica
MicroRNA
miR-146b
Resumé en portugais
MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificantes que regulam a expressão de mRNAs alvo e são comumente desregulados no câncer. No câncer de tireoide, miR-146b é o miRNA mais superexpresso, estando associado à oncogênese e agressividade tumoral, levando à características clínicas e patológicas de pior prognóstico. Desta forma, visamos compreender o papel de miR-146b em um modelo agressivo de câncer de tireoide usando a metodologia de edição genica CRISPR/Cas9n. A linhagem KTC2 (carcinoma anaplásico humano) que expressa um alto nível de miR-146b foi cotransfectada com plasmídeos pSp-Cas9n-miR-146b-guiaA-puromicina e pSp-Cas9n-miR-146b-guiaB-GFP, contendo RNAs guia projetados para flanquear a região do precursor de miR-146b, impedindo a formação do pré-miR. Após a transfecção, foram selecionados dois clones, KTC2-Cl1 e KTC2-Cl3, e uma linha celular controle, KTC2-CTR, cotransfectada com ambos os plasmídeos sem RNA guia. Após a seleção dos clones e confirmação da edição de MIR146B pelo sequenciamento da região alvo, a expressão de miR-146b foi analisada por qPCR a partir do RNA total extraído, e seguida de ensaios de contagem celular, viabilidade, migração, formação de colônias e xenotransplante em camundongos imunossuprimidos. As linhagens KTC2 Cl1 e Cl3 apresentaram diminuição na expressão de miR-146b em relação ao controle, apresentando também redução na proliferação, viabilidade celular, migração e formação de colônias. E ainda, no experimento de xenotransplante, não houve crescimento tumoral das células KTC2-Cl1, injetadas no flanco de camundongos nude. Dessa forma, a modulação da expressão de miR-146b por edição genica utilizando CRISPR/Cas9n mostrou-se eficiente e constitui uma ferramenta molecular para o entendimento do papel dos miRNAs no câncer de tireoide.
 
Titre en anglais
Effect of gene editing and expression modulation of MIR146B in thyroid cancer.
Mots-clés en anglais
Anaplastic thyroid cancer
CRISPR/Cas
Gene editing
MicroRNA
miR-146b
Resumé en anglais
MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs that regulate the expression of target mRNAs and are commonly deregulated in cancer. In thyroid cancer, miR-146b is the most overexpressed miRNA, associated with oncogenesis and tumor aggressiveness, leading to clinical and pathological characteristics of worse prognosis. Therefore, we aim to understand the role of miR-146b in an aggressive model of thyroid cancer using the CRISPR/Cas9n gene editing methodology. The KTC2 strain (human anaplastic carcinoma) expressing a high level of miR-146b was cotransfected with plasmids pSp-Cas9n-miR-146b-guideA-puromycin and pSp-Cas9n-miR-146b-guideB-GFP, containing guide RNAs designed to flank the precursor region of miR-146b, preventing pre-miR formation. Following the transfection, two clones were selected, KTC2-Cl1 and KTC2-Cl3, and also a control cell line, KTC2-CTR, cotransfected with both plasmids with no guide RNA. After selection of clones and MIR146B editing confirmed by sequencing, miR-146b expression was analyzed by real-time PCR from the total RNA extracted, and cell counting, viability, migration, colony and xenotransplantation assays were performed. The KTC2 Cl1 and Cl3 strains showed a decrease in the expression of miR-146b in relation to the control, also showing reduced proliferation, cell viability, migration, and colony formation. Furthermore, in the xenograph experiment, no tumor growth was observed of the KTC2-Cl1 cells, injected into the flank of nude mice. Thus, a modulation of miR-146b expression by gene editing using CRISPR / Cas9n proved to be efficient as a molecular tool for understanding the role of miRNAs in thyroid cancer.
 
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Date de Publication
2022-12-21
 
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