MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificantes que regulam a expressão de mRNAs alvo e são comumente desregulados no câncer. No câncer de tireoide, miR-146b é o miRNA mais superexpresso, estando associado à oncogênese e agressividade tumoral, levando à características clínicas e patológicas de pior prognóstico. Desta forma, visamos compreender o papel de miR-146b em um modelo agressivo de câncer de tireoide usando a metodologia de edição genica CRISPR/Cas9n. A linhagem KTC2 (carcinoma anaplásico humano) que expressa um alto nível de miR-146b foi cotransfectada com plasmídeos pSp-Cas9n-miR-146b-guiaA-puromicina e pSp-Cas9n-miR-146b-guiaB-GFP, contendo RNAs guia projetados para flanquear a região do precursor de miR-146b, impedindo a formação do pré-miR. Após a transfecção, foram selecionados dois clones, KTC2-Cl1 e KTC2-Cl3, e uma linha celular controle, KTC2-CTR, cotransfectada com ambos os plasmídeos sem RNA guia. Após a seleção dos clones e confirmação da edição de MIR146B pelo sequenciamento da região alvo, a expressão de miR-146b foi analisada por qPCR a partir do RNA total extraído, e seguida de ensaios de contagem celular, viabilidade, migração, formação de colônias e xenotransplante em camundongos imunossuprimidos. As linhagens KTC2 Cl1 e Cl3 apresentaram diminuição na expressão de miR-146b em relação ao controle, apresentando também redução na proliferação, viabilidade celular, migração e formação de colônias. E ainda, no experimento de xenotransplante, não houve crescimento tumoral das células KTC2-Cl1, injetadas no flanco de camundongos nude. Dessa forma, a modulação da expressão de miR-146b por edição genica utilizando CRISPR/Cas9n mostrou-se eficiente e constitui uma ferramenta molecular para o entendimento do papel dos miRNAs no câncer de tireoide.

MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs that regulate the expression of target mRNAs and are commonly deregulated in cancer. In thyroid cancer, miR-146b is the most overexpressed miRNA, associated with oncogenesis and tumor aggressiveness, leading to clinical and pathological characteristics of worse prognosis. Therefore, we aim to understand the role of miR-146b in an aggressive model of thyroid cancer using the CRISPR/Cas9n gene editing methodology. The KTC2 strain (human anaplastic carcinoma) expressing a high level of miR-146b was cotransfected with plasmids pSp-Cas9n-miR-146b-guideA-puromycin and pSp-Cas9n-miR-146b-guideB-GFP, containing guide RNAs designed to flank the precursor region of miR-146b, preventing pre-miR formation. Following the transfection, two clones were selected, KTC2-Cl1 and KTC2-Cl3, and also a control cell line, KTC2-CTR, cotransfected with both plasmids with no guide RNA. After selection of clones and MIR146B editing confirmed by sequencing, miR-146b expression was analyzed by real-time PCR from the total RNA extracted, and cell counting, viability, migration, colony and xenotransplantation assays were performed. The KTC2 Cl1 and Cl3 strains showed a decrease in the expression of miR-146b in relation to the control, also showing reduced proliferation, cell viability, migration, and colony formation. Furthermore, in the xenograph experiment, no tumor growth was observed of the KTC2-Cl1 cells, injected into the flank of nude mice. Thus, a modulation of miR-146b expression by gene editing using CRISPR / Cas9n proved to be efficient as a molecular tool for understanding the role of miRNAs in thyroid cancer.