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Doctoral Thesis
DOI
https://doi.org/10.11606/T.42.2020.tde-14022020-100006
Document
Author
Full name
Marcelo Medina de Souza
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2019
Supervisor
Committee
Santelli, Glaucia Maria Machado (President)
Coltri, Patricia Pereira
Rodas, Andrea Cecilia Dorion
Rodrigues, Stephen Fernandes de Paula
Title in Portuguese
Preparação de nanobiosistemas para detecção do microRNA tumoral miR-21.
Keywords in Portuguese
AuNPs
bioconjugação
detecção de câncer
microRNAs
miR-21
Abstract in Portuguese
Nessa tese foi desenvolvido um método para obtençãode sondas de DNA baseadas em nanopartículas de ouro, aqui denominadas nanobiossistemas, que utiliza baixas concentraçõesde cloreto de sódio e DNA e reduzido tempo de reação. Essas sondas foram utilizadas em ensaios de detecção do microRNA tumoral miR-21 maduro por meio de espectroscopia Raman e espectroscopia e microscopia de fluorescência. As AuNPs foram sintetizadas pelo processo de redução do citrato e apresentaram tamanho médio de 17 nm e ressonÇancia de plasmon de superfície (SPR) em _ 524 nm, verificados por microscopia eletrônica de transmissão e espectroscopia UV-Visível, respectivamente. Os nanobiossistemas foram preparados em 2 etapas, que consistem na estabilização da suspensão de AuNPs com dATP e PEG-SH e posterior substituição do dATP por oligonucleotídeos modificados com um grupo tiol e um fluoróforo Cy5 nas porções 5 e 3, respectivamente. Os nanobiossistemas foram caracterizados por espectroscopia UV-Visível, espalhamento de luz dinâmico, potencial Zeta e microscopia eletrônica de transmissão. Após as modificações, ambos os nanobiossistemas apresentaram um deslocamento na banda RPSL para _ 530 nm e uma banda em 260 nm, que é caracter ística dos oligonucleotídeos, e tamanho hidrodinâmico de 38 nm. O potencial Zeta passou de -21 mV para aproximadamente -38 mV para os nanobiossistemas. Esses resultados mostram que o método aqui desenvolvido foi útil para funcionalizar a superfície das AuNPs com oligonucleotídeos de modo simples e rápido. Para avaliar a capacidade de detecção miR-21 foi testado a hibridização do miR-21 proveniente de 3 fontes: sintético, obtido comercialmente, extraído de vesículas extracelular e intracelular em células das linhagens celular tumoral MCF-7 e epitelial de mama MCF-10A. Para a linhagem MCF-7, as detecções por espectroscopia de fluorescência apresentaram um limite de detecção de 0,18 nM e limite de quantificação de 0,55 nM, para o miR-21 sintético. Enquanto a espectroscopia Raman apresentou um limite de detecção de 6,7 nM e limite de quantificação de 20,4 nM. Ambos nanobiossistemas apresentaram boa especificidade, pois foram capazes de distinguir entre sequência de miR-21 com apenas uma base alterada. Para os testes de detecção com miR-21 proveniente de vesículas extracelular, o limite de detecção foi de 214 ng/mL de miR-21 e limite de quantificação 651 ng/mL e limite de detecção 0,74 ng de miR-21 e limite de quantificação 2,24 ng/mL, para a espectroscopia Raman e de fluorescência, respectivamente. Esses resultados mostraram que a espectroscopia por fluorescência foi mais sensível para detecção do miR-21, quando comparado ao Raman. Foram realizados também testes de detecção intracelular em células MCF-7 e MCF-10A utilizando imagens de fluorescência. Os resultados mostraram que o nanobiossistema baseado em fluorescência é sensível à diferença de expressão entre células tumorais e células normais, como foi verificado por meio da RT-qPCR.
Title in English
Preparation of nanobiossystems for detection of miR-21 tumor microRNA.
Keywords in English
AuNPs
bioconjugation
cancer detection
microRNAs
miR-21
Abstract in English
In this thesis were developed a method to obtained AuNPs-based DNA probes, named nanobiosystem, which use low concentrations of NaCl and DNA and reduced reaction time. These probes were used to detect the mature tumoral microRNA miR21. The AuNPs were synthesized by the process of reducing citrate and presented an average size of 17 nm and SPR band of 524 nm. The nanobiosystem were prepared in two steps, which consists in the stabilization of the suspension of AuNPs with dATP and PEG-SH and later replacement of dATP by oligonucleotides modified with a thiol group and a fluorophore Cy5 in the portions 5 e 3, respectively. The Nanobiosystems were characterized by UV-Vis spectroscopy, dynamic light scattering, Zeta potential, and transmission electron microscopy. Both bionanosystems presented a shift in SPR band to 530 nm and a new band at 260 nm, which is characteristic of oligonucleotides, and hydrodynamic size of 38 nm. Zeta potential increased from -21 mV to -38 mV for the AuNPs and nanobiosistemas, respectively. These results show that the method developed here was useful for functionalizing the surface of AuNPs with oligonucleotides in a simple and fast way. To study the ability of nanobiosystems to detect miR-21, we tested a hybridization of miR-21 from 3 sources: synthetic, commercially obtained, extracted from extracellular and intracellular vesicles in MCF-7 and MCF-10A cells. Fluorescence spectroscopy detections had a detection limit of 0.18 nM and a quantitation limit of 0.55 nM for synthetic miR-21. While Raman spectroscopy showed a detection limit of 6.7 nM and quantitation limit of 20.4 nM. Both nanobiosystems showed good specificity because they were able to distinguish between miR-21 sequence with only one altered base. For detection tests with miR-21 from extracellular vesicles, the detection limit was 214 ng/mL of miR-21 and the quantitation limit of 651 ng/mL and detection limit 0.74 ng/mL of miR-21 and quantitation limit 2,24 ng/mL for Raman and fluorescence spectroscopy, respectively. These results showed that fluorescence spectroscopy was more sensitive for miR-21 detection when compared to Raman. Intracellular detection tests were also performed on MCF-7 and MCF-10A cells using fluorescence image. The results showed that the fluorescence-based nanobiosystem is sensitive to the difference in expression between tumor cells and normal cells, as verified by RT-qPCR.
 
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Release Date
2022-02-13
Publishing Date
2020-02-18
 
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