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Doctoral Thesis
DOI
https://doi.org/10.11606/T.42.2020.tde-13022020-162011
Document
Author
Full name
Mychel Raony Paiva Teixeira Morais
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2019
Supervisor
Committee
Zorn, Telma Maria Tenorio (President)
Freitas, Vanessa Morais
Ronsein, Graziella Eliza
Thieme, Karina
Title in Portuguese
Estudo da matriz extracelular metanéfrica e dos efeitos do diabetes mellitus materno sobre o desenvolvimento renal em camundongos.
Keywords in Portuguese
Camundongo
Desenvolvimento renal
Diabetes mellitus
Matriz extracelular
Proteômica
Abstract in Portuguese
O desenvolvimento renal em gestações diabeticas vem sendo amplamente investigado, porém, pouco se sabe sobre as alterações na matriz extracelular (MEC) metanefrica nesta condição. A MEC exerce um papel essencial no desenvolvimento renal, portanto, alterações na sua composição, organização e propriedades fisicoquímicas durante a gestação hiperglicemica podem ter efeitos negativos sobre este órgão. Nossa hipótese e a de que o diabetes mellitus (DM) materno restringe o desenvolvimento dos rins e altera a composição e turnover da MEC metanefrica. Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do DM materno sobre a estrutura dos rins e função urinaria em fetos pre-termo, bem como caracterizar a composição, organização e alterações na MEC metanefrica, usando um modelo de gestação complicada por DM tipo 1 induzido com aloxana (40 mg/kg, dose única) em camundongos, sem tratamento insulinico. Neste modelo, fêmeas normoglicêmicas (controle) e diabéticas foram acasaladas com machos normoglicemicos entre o 30o e 50o dia pos-indução, e os fetos de maes normoglicemicas e diabeticas (FMN e FMD, respectivamente) foram coletados no 19o dia embrionário para análise. Comparados aos FMN, os FMD foram hiperglicêmicos, e sofreram restrição de crescimento intrauterino caracterizado por retardo do desenvolvimento corpóreo em relação ao desenvolvimento da cabeça. A análise do líquido amniótico revelou a ocorrência de polidramnio decorrente de poliuria e glicosuria fetal no grupo diabetico. Os FMD subdesenvolvidos apresentaram rins com massa e volume significativamente menores em comparação aos FMN. A análise estereologica mostrou redução da proporção volumetrica do cortex renal e dilatação da pelve renal nos FMD. Observamos redução do número de nefrons (maduros e imaturos), associado a um aumento do volume corpuscular e dilatação dos túbulos contorcidos nos FMD comparados aos FMN. A análise ultraestrutural da barreira de filtração glomerular por microscopia eletrônica de transmissão revelou espessamento segmentar da membrana basal glomerular (MBG) e perda da morfologia típica dos pés terminais dos podócitos nos glomerulos maduros dos FMD. A composição do matrisoma metanefrico foi investigada pela primeira vez em camundongos por espectrometria de massas em tandem usando amostras enriquecidas para proteínas de MEC. Identificamos 86 proteínas estruturais (colagenos, glicoproteinas adesivas e proteoglicanos) e 75 associadas a MEC (reguladoras, afiliadas e fatores secretados), incluindo marcadores de maturação da MBG. A análise proteômica mostrou aumento de emilina-3 e COL6A6 nos rins dos FMD, validado posteriormente por immunoblot. A analise pela PCR em tempo real e por imunomarcação mostrou acúmulo de colágeno IV nos rins de FMD, particularmente de COL4A1 nos glomerulos maduros. Também observamos um discreto aumento de panlaminina e redução de perlecam nos glomerulos maduros, e acumulo de agrim na superficie apical dos tubulos contorcidos de FMD por imunohistoquimica. Zimografia em gel e immunoblot revelaram ativação reduzida de MMP-2 e MT1-MMP, respectivamente, nos rins de FMD. Verificamos tambem aumento nos niveis de TIMP-2 por PCR em tempo real, immunoblot e imunohistoquimica. Concluímos que o DM materno restringiu o desenvolvimento renal intrauterino em camundongos e promoveu acúmulo de MEC nos rins fetais, particularmente de colágeno IV e VI, devido ao desbalanço na expressão e turnover de suas proteínas.
Title in English
Study of the metanephric extracellular matrix and the effects of maternal diabetes mellitus on kidney development in mice.
Keywords in English
Diabetes mellitus
Extracellular matrix
Kidney development
Mouse
Proteomics
Abstract in English
Kidney development in diabetic pregnancies has been widely studied, however, little is known about the alterations on the metanephric extracellular matrix (ECM) in this gestational condition. The ECM plays an essential role during kidney development, therefore, changes in its composition, organization and physicochemical properties must have a negative effect on this organ. We hypothesize that the maternal diabetes mellitus (DM) restricts kidney development and alters metanephric ECM composition and turnover. Thus, this study aimed to investigate the effects of the maternal DM on the kidney structure and urinary production rate of pre-term fetuses, as well as to globally characterize the composition, organization and alterations on the metanephric ECM, using a model of pregnancy complicated by type 1 diabetes induced by a dose of alloxan (40 mg/kg) in mice, without insulin therapy. In this model, normoglycemic (control) and diabetic females were mated with normoglycemic males from the 30th to the 50th day post-induction, and fetuses of normoglycemic and diabetic mothers (FNM and FDM, respectively) were collected on the 19th embryonic day (E19). Compared to FNM, we observed that FDM were severely hyperglycemic and asymmetrically growth restricted characterized by retarded body growth in relation to head development. Growth-restricted FDM had kidneys with reduced mass and volume compared to normal FMN. Amniotic fluid analysis revealed polyhydramnios due to fetal polyuria and glycosuria in the diabetic group. Stereological analysis showed reduced volumetric proportion of the renal cortex and pelvis dilation in FDM. We observed reduced nephron endowment associated to increased corpuscular volume and dilation of convoluted tubules in FMD compared to FNM. Ultrastructural analysis of the glomerular filtration barrier by transmission electron microscopy revealed segmental thickening of the glomerular basement membrane (GBM) and morphological alterations of the foot processes of podocytes in mature glomeruli of FDM. The metanephric matrisome in mice was investigated for the first time by tandem mass spectrometry using samples enriched for ECM proteins. We identified 86 structural (collagens, adhesive glycoproteins and proteoglycans) and 75 ECM-associated proteins (regulatory, affiliated and secreted factors), including known markers of GMB maturity. The proteomic analysis showed increased levels of EMILIN-3 and COL6A6 in FDM kidneys, which was further validated by immunoblot. Real-time PCR and immunostaining analyses showed accumulation of collagen IV in FDM kidneys, particularly of COL4A1 in mature glomeruli. We also found a discrete increase of panlaminin and reduction of perlecan in mature glomeruli, besides accumulation of agrin on the apical surface of convoluted tubules of FDM by immunohistochemistry. In gel zymography and immunoblot revealed reduced activation of MMP-2 and MT1- MMP, respectively, in FDM kidneys. We also verified increased levels of TIMP-2 by real-time PCR, immunoblot and immunohistochemistry. These analyses allowed us to conclude that the maternal DM restricted intrauterine kidney development in mice and promoted ECM accumulation in the fetal kidney, particularly of collagen, due to a misbalanced expression and turnover of its proteins.
 
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Release Date
2022-02-12
Publishing Date
2020-02-14
 
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