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Doctoral Thesis
DOI
https://doi.org/10.11606/T.42.2020.tde-12022020-163347
Document
Author
Full name
Ana Carolina Lima Ralph
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2019
Supervisor
Committee
Freitas, Vanessa Morais (President)
Colquhoun, Alison
Fiore, Ana Paula Zen Petisco
Otake, Andreia Hanada
Title in Portuguese
Análise dos marcadores de células tronco tumorais em linhagens tumorais resistentes ao estresse.
Keywords in Portuguese
Acidose
Heterogeneidade tumoral
Hipóxia
Microambiente tumoral
Plasticidade tumoral
Privação de glicose
Reprogramação metabólica
Abstract in Portuguese
Tumores sólidos, tais como câncer de mama, possuem um microambiente particularmente hostil devido a perfusão sanguínea insuficiente, supressão de células regulatórias, disturbios metabólicos, dentre outros fatores que dificultam as terapias antitumorais. Células epiteliais adaptadas a essas condições, passam por uma seleção natural, adquirindo características que favorecem diretamente a progressão tumoral. Apesar de muitos estudos terem demonstrado diferenças importantes entre o interstício da célula tumoral e o da célula normal, as funções celulares nessas condições permanecem pouco conhecidas. Levando em consideração a significância do microambiente na progressão do câncer, esse estudo visou avaliar a capacidade da acidose, da baixa concentração de glicose e da hipoxia em modular genes, proteínas e o comportamento celular na transição epitelio-mesenquimal (TEM) e no fenotipo tronco tumoral. No presente estudo foram utilizadas as linhagens de adenocarcinoma mamario MDA-MB-231 e MCF7, além da NTERA2 e fibroblastos, para controle positivo e cultivo tridimensional, respectivamente. A partir dos resultados de viabilidade celular, as linhagens tumorais foram expostas a três condições ambientais restritivas: (1) cultivo com pH 6,2 durante 24h ou a cada 72h por 4 semanas, de forma a reproduzir as condições agudas e crônicas do microambiente ácido; (2) metade da concentração de glicose (0,5 g/L), para reproduzir a privação de nutrientes; ou (3) tratamento com cloreto de cobalto 200 µM, para induzir hipoxia química. Os resultados iniciais demonstraram que 71,43% dos genes relacionados ao fenotipo tronco foram diferencialmente expressos na MDAMB-231, enquanto que na MCF7 foram apenas 23,81%. No entanto, constatou-se que a linhagem MCF7, passa por um processo anterior ao fenotipo tronco. Após exposição ao pH 6.2, ela passa de um fenotipo epitelial para mesenquimal, demonstrando expressão de diversos marcadores de TEM (Snai1, Zeb1, E-caderina, b-catenina e vimentina). No entanto, a expressão de marcadores proteicos de fenotipo tronco só se tornam significante quando e associado a ausência de substrato. A adição de mais um fator estressante altera inclusive o potencial migratório e clonogênico das MCF7. Por outro lado, a linhagem MDA-MB-231 apresentou-se mais sensível a deficiência de glicose. A condição de glicose 0,5g/L induziu alteracoes na expressão de proteínas metabólicas (p-AMPK e AMPK), importantes alterações morfológicas mitocondriais e em proteínas responsáveis pela dinâmica mitocondrial (p-DRP1, DRP1, MFN1, MFN2). Tal sensibilidade a privação de glicose contribui significativamente para o aumento gênico e protéico de marcadores para o fenotipo tronco (Snai1, Nanog, Pou5f1/Oct4, Notch1) e enriquecimento da população celular CD44+/CD24-/low. Apesar de nãoo ter sido encontrado alterações funcionais importantes na migração e clonogenicidade, assim como na MCF7 em condições acidícas, a MDA-MB-231 quando cultivada na forma tridimensional e na presençaa de fibroblastos, consegue induzir o aumento na migração de fibroblastos na glicose 0,5g/L. Os resultados aqui apresentados contribuem para o entendimento de em que cada fator microambiental pode influenciar nas alterações fenotipicas celulares e realça a importância da associação intercelular como forma de colaborar para a progressão do tumor.
Title in English
Analysis of Tumor Stem Cell Markers In Stress-Resistant Tumor Lines.
Keywords in English
Acidosis
Glucose deprivation
Hypoxia
Metabolic reprograming
Tumor heterogeneity
Tumor microenvironment
Tumor plasticity
Abstract in English
Solid tumors, such as breast cancer, have a particularly hostile microenvironment due to insufficient blood perfusion, regulatory cell suppression, metabolic disorders, among other factors that hamper antitumor therapies. Epithelial cells adapted to these conditions, go through a natural selection, acquiring characteristics that directly favor the tumor progression. Although many studies have shown important differences between the interstitium of the tumor cell and that of the normal cell, cellular functions under these conditions remain poorly understood. Taking into account the significance of the microenvironment in the progression of cancer, this study aimed to evaluate the capacity of acidosis, low glucose concentration and hypoxia in modulating genes, proteins and cellular behavior in the epithelial-mesenchymal transition (EMT) and cancer stem cell phenotype. In the present study, mammary adenocarcinoma MDA-MB-231 and MCF7, as well as NTERA2 and fibroblasts, were used for positive control and three-dimensional culture, respectively. From the cell viability results, tumor cell lines were exposed to three restrictive environmental conditions: (1) culture at pH 6.2 for 24h or every 72h for 4 weeks, in order to reproduce the acute and chronic conditions of the acidic microenvironment; (2) low glucose concentration (0.5 g / L), to reproduce nutriente deprivation; or (3) treatment with 200 µM cobalt chloride to induce chemical hypoxia. The initial results showed that 71.43% of the genes related to the stem phenotype were differentially expressed in the MDA-MB-231, whereas in the MCF7 they were only 23.81%. However, it was verified that the lineage MCF7, goes through a process previous to the stem cell phenotype. After exposure to pH 6.2, it changes from an epithelial to mesenchymal phenotype, demonstrating the expression of several EMT markers (Snai1, Zeb1, E-cadherin, b-catenin and vimentin). However, the expression of protein markers of stem phenotype only become significant when it is associated with absence of substrate (3D culture). The addition of one more stress factor alters even the migratory and clonogenic potential of MCF7. On the other hand, the MDA-MB-231 strain was more sensitive to glucose deficiency. The glucose concentration of 0.5 g/L induced alterations in the expression of metabolic proteins (p-AMPK and AMPK), important mitochondrial morphological alterations and proteins responsible for mitochondrial dynamics (p-DRP1, DRP1, MFN1, MFN2). Such sensitivity to glucose deprivation contributes significantly to the gene and protein increase of cancer stem cell markers (Snai1, Nanog, POU5F1/Oct4, Notch1) and enrichment of the CD44+/CD24-/low cell population. Although important functional changes in migration and clonogenicity have not been found, as well as in MCF7 under acidic conditions, MDA-MB-231 when cultured in three-dimensional in the presence of fibroblasts induce the increase in the migration of fibroblasts in glucose 0.5g/L condition. The results presented here contribute to the understanding of how each microenvironmental factor can influence cellular phenotypic alterations and highlights the importance of the intercellular association as a way of collaborating for tumor progression.
 
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Release Date
2022-02-11
Publishing Date
2020-02-18
 
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