SCRATCH2 e NEUROD4 são fatores de transcrição co-expressos na zona intermediária do tubo neural embrionário, onde progenitores neurais que emergiram recentemente do ciclo celular residem e irão migrar para as camadas mais externas do tubo neural. Tanto o NEUROD4 quanto o SCRATCH2 reconhecem a sequência E-box para a regulação da transcrição de genes alvo, sugerindo que eles podem atuar juntos na regulação gênica no início da diferenciação neural. Com isso, propomos a hipótese de que esses fatores de transcrição podem inibir a proliferação celular ou regular genes relevantes para os estágios iniciais de diferenciação. Para isso, superexpressamos NEUROD4 e SCRATCH2 no tubo neural por eletroporação in ovo. Em seguida, quantificamos o número de células mitóticas (ppH3-positivas). A superexpressão de NEUROD4 reduziu a porcentagem de células positivas para pHH3. No entanto, a superexpressão de SCRT2 não alterou esse índice mitótico. Finalmente, para identificar possíveis genes-alvo regulados por SCRT2, realizamos análises de bioinformática em dados de RNAseq e CUT & RUN realizados em tubos neurais superexpressando SCRT2. Nossa análise sugere que os genes LHX9 e BARHL1 são possíveis alvos indiretos do SCRT2, regulados pela ativação dos fatores de transcrição NEUROG1 e ASCL1. Em seguida, usamos os dados de scRNAseq do tubo neural de camundongo E11.5, E12.5 e E13.5 para correlacionar os níveis de expressão de SCRT2 e NEUROD4 com os genes-alvo potenciais em células individuais. Nossos dados mostram que nas células neurais E11.5, aquelas que apresentam níveis elevados de SCRT2, o fator de transcrição ISLET-1 não é expresso. ISLET-1 é um marcador para o interneurônio dorsal 3 na medula espinhal. Por outro lado, ISLET-1 é expresso em células com altos níveis de NEUROD4. Em E12.5, SCRT2 é expresso em duas linhagens celulares que expressam os marcadores para o interneurônio dorsal 4 (DI4) e 5 (DI5). Os níveis de expressão de NEUROD4 e ISLET-1 eram muito baixos neste estágio. Em 13,5 o SCRT2 permaneceu associado às subpopulações DI4 e DI5. Assim, propomos que SCRT2 reprime ISLET-1 em precursores pós-mitóticos iniciais e pode desempenhar um papel na restrição do domínio DI3. Além disso, em estágios posteriores, o SCRT2 pode contribuir com o estabelecimento ou manutenção dos compartimentos DI4 e DI5.

SCRATCH2 and NEUROD4 are transcription factors co-expressed in the intermediate zone of the embryonic neural tube, where neural progenitors that have recently emerged from the cell cycle, reside and will migrate to the outermost layers of the neural tube. Both NEUROD4 and SCRATCH2 recognize the E-box sequence for transcriptional regulation of target genes suggesting that they can act together in gene regulation in the beginning of neural differentiation. With this, we propose the hypothesis that these transcription factors can inhibit cell proliferation or regulate genes relevant to the initial stages of differentiation. For this, we overexpressed NEUROD4 and SCRATCH2 in the neural tube by in ovo electroporation. We then quantified the number of mitotic cells (ppH3-positive). Overexpression of NEUROD4 reduced the percentage of pHH3 positive cells. However, overexpression of SCRT2 did not alter this mitotic index. Finally, to identify possible target genes regulated by SCRT2, we performed bioinformatics analysis on RNAseq and CUT&RUN data performed neural tubes overexpressing SCRT2. Our analysis suggests that the LHX9 and BARHL1 genes are possible indirect targets of SCRT2, regulated through the activation of the transcription factors NEUROG1 and ASCL1. We then used scRNAseq data from E11.5, E12.5 and E13.5 mouse neural tube to correlate SCRT2 and NEUROD4 expression levels with the potential target genes in individual cells. Our data show that in E11.5 neural cells those that have high levels of SCRT2, the transcription factor ISLET-1 is not expressed. ISLET-1 is marker for dorsal interneuron 3 in the spinal cord. Conversely, ISLET-1 is expressed in cells with high levels of NEUROD4. In E12.5, SCRT2 is expressed in two cell lineages that express the markers for dorsal interneuron 4 (DI4) and 5 (DI5). Both NEUROD4 and ISLET-1 expression levels were very low at this stage. In 13.5 SCRT2 remained associated with DI4 and DI5 subpopulations. Thus, we propose that SCRT2 represses ISLET-1 in early postmitotic precursors and might play a role in restricting the DI3 domain. Also, in later stages, SCRT2 might contribute with the establishment or maintenance of DI4 and DI5 compartments.