Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.42.2021.tde-03082021-115728
Documento
Autor
Nome completo
Maria Raquel Unterkircher Galheigo
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2021
Orientador
Banca examinadora
Jaeger, Ruy Gastaldoni (Presidente)
Carvalho, Hernandes Faustino de
Pinhal, Maria Aparecida da Silva
Santos, Marinilce Fagundes dos
Título em português
Estudo da interação entre o peptídeo derivado da laminina 111, C16, e a subunidade 1 da integrina β 1 em células de linhagens mamárias: consequências morfofuncionais.
Palavras-chave em português
Câncer de mama
Endocitose
Integrina β 1
Laminina 111
Resumo em português
O câncer de mama está entre as principais causas de morte provocadas por neoplasias no mundo. Nesse contexto, a matriz extracelular (MEC), que compõe o microambiente tumoral, assume papel importante durante a carcinogênese. A laminina-111 é a principal glicoproteína da MEC e exibe diferentes peptídeos bioativos que influenciam a biologia do câncer. Nossos trabalhos anteriores demonstram que o peptídeo derivado da laminina 111, C16, regula a migração, invasão e a formação de invadopódios em diferentes células tumorais. Outros achados indicam que os mecanismos regulatórios relativos aos efeitos do C16 se devem à integrina β 1. Isso nos levou a investigar uma possível interação entre o peptídeo C16 e a integrina β 1 nas células de mama, bem como as consequências morfofuncionais resultantes dessa interação. Assim, os resultados obtidos neste trabalho mostraram que as células de mama aderem ao peptídeo C16 e que essa adesão é diminuída com o knockdown da integrina β 1 por RNAi. Além disso, mostramos que o C16 conjugado à rodamina se sobrepõe à integrina β 1 ativa nas células mamárias, indicando uma possível colocalização entre ambos. Através de citometria de fluxo, mostramos também que essa subunidade pode ser ativada por aquele peptídeo. Ainda, as análises das amostras de células MDA-MB-231 tratadas com C16 conjugado a partículas de Nanogold mostraram o peptídeo decorando a membrana e dentro de vesículas no interior das células. Foi também demonstrado que o peptídeo é internalizado pelas células de mama com o passar do tempo e que essa internalização é diminuída por inibidor químico de dinamina e por RNAi contra caveolina-1. Após a internalização, parte desse peptídeo é direcionado para via endocítica, tendo sido encontrado em endossomos iniciais e lisossomos. Juntos, os resultados sugerem que, após a interação com a membrana e possível ativação da integrina β 1, as células de mama endocitam o peptídeo C16 através de vesículas revestidas por caveolina-1. Após endocitose, o peptídeo será, pelo menos em parte, degradado nos lisossomos.
Título em inglês
Study of the interaction between laminin 111-derived peptide, C16, and β 1 integrin in breast cells: morphofunctional consequences.
Palavras-chave em inglês
β 1
Breast câncer
Endocytosis
Integrin
Laminin 111
Resumo em inglês
Breast cancer is among the most frequent worldwide mortality. Tumor microenvironment undertakes important role during cancer progression. Different cells enmeshed in the extracellular matrix (ECM) compose such microenvironment. Laminin 111 is a major ECM glycoprotein and exhibits different bioactive peptides influencing tumor biology. We have demonstrated that the laminin-derived peptide C16 (KAFDITYVRLKF, short arm of gamma 1 chain) regulates migration, invasion, and invadopodia formation in different cancer cells. Our findings indicate that regulatory mechanisms underlying C16 effects are related to β 1 integrin. This prompted us to investigate the interaction between C16 peptide and β 1 integrin in breast cancer cells as well as its morpho functional effects. These cells attach to C16 peptide and this attachment is inhibited by β 1 integrin depletion by siRNA. Moreover, rhodamine-C16 colocalized with activated β 1 integrins in breast cancer cells. Flow cytometry assay showed that C16 increased β 1 activation after 20 minutes in these cells. Cellular localization of C16 was carried out by transmission electron microscopy (TEM) and time-lapse fluorescence microscopy. TEM showed nanogold-conjugated C16 decorating cell membrane and inside cellular vesicles. The presence of C16 inside vesicles would imply peptide endocytosis. Time-lapse confocal microscopy displayed peptide C16 internalized by breast cells over time and decreased internalization of this peptide by dynasore in MCF-7 cells. Moreover, fluorescence microscopy also showed that a caveolin-1 depletion by siRNA decreases C16 internalization. According to these results, we hypothesized whether the endocytosed peptide would be directed to the endosome-lysosome pathway for degradation. Time-lapse and immunofluorescence illustrated part of the internalized peptide colocalized with early endosomes and lysosomes in the studied cells. Taken together, our results suggested that after membrane interaction and β 1 integrin activation, breast cells would internalize peptide C16, which, at least in part, will be degraded in lysosomes.
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Data de Publicação
2022-12-08