A leptospirose é uma zoonose importante para a saúde pública, causada por bactérias espiroquetas do gênero Leptospira. A resposta imune inata contra essas bactérias depende em grande parte da fagocitose e da ativação do Sistema Complemento. Este sistema é composto por diversas proteínas solúveis ou presentes na superfície celular, que atuam tanto na imunidade inata quanto na adaptativa. C3 é a proteína mais abundante desse sistema e a sua importância fica evidenciada especialmente em pacientes deficientes, pois são muito suscetíveis a repetidas infecções. Diversos estudos têm mostrado que a proteína C3 desempenha um papel fundamental no combate a infecções, responsável pela geração de opsoninas que facilitam a eliminação de microrganismos, entre estes as leptospiras, mas o papel de C3 para a diferenciação e resposta intracelular em leucócitos ainda é pouco entendido. Para entender melhor a importância de C3 para o desenvolvimento de células da imunidade inata, este trabalho buscou comparar diversos parâmetros celulares importantes para a fagocitose de leptospiras em macrófagos de camundongos C57Bl/6 (selvagens) e C57Bl/6 C3-/- (deficientes de C3). Inicialmente, as populações celulares presentes no exsudado peritoneal foram avaliadas por citometria de fluxo. Observamos aumento do número de macrófagos residentes (F4/80high) e menor número de macrófagos diferenciados a partir de monócitos (F4/80low) em camundongos deficientes de C3, demonstrando que talvez o recrutamento celular destas células esteja sendo afetado, implicando em menor afluxo destas células inflamatórias para o sítio inflamatório. Como o citoesqueleto de macrófagos desempenha um papel crucial para a função fagocítica, e tendo em vista sua importância para a migração e formação de evaginações e invaginações que permitem o englobamento de partículas, analisamos a presença e distribuição de -tubulina e F-actina em macrófagos peritoneais e diferenciados da medula óssea. A ausência de C3 afetou de maneira significativa a morfologia e tamanho dessas células, uma vez que na ausência de C3 os macrófagos apresentaram menor intensidade de marcação com anti--tubulina e redução do tamanho celular (área), evidenciada pelo uso de faloidina (reage com F-actina). Em seguida, a presença das seguintes moléculas de superfície celular foi quantificada por citometria de fluxo: CD11a/CD18, CD11b, CD11c, CD64, CD197, CD206, CD282, CD284, CD36, CD80, MHC II e CD21/CD35. A presença dos seguintes receptores CD282 (TLR2), CD64 (FcR1) e CD36 (scavenger receptor ) foi aproximadamente 20 % menor em macrófagos diferenciados da medula óssea de camundongos deficientes de C3, quando comparada com os macrófagos de camundongos selvagens. Entretanto, a presença desses mesmos receptores foi semelhante em macrófagos peritoneais dos dois grupos de camundongos. Por outro lado, a presença do receptor de Complemento 4 (CR4; CD11c/CD18) foi seis vezes mais elevada em macrófagos peritoneais e diferenciados da medula óssea de B6.C3-/-. Avaliamos também a fagocitose de Zimosan e E. coli K12 que foi maior em macrófagos B6.C3-/-, o que pode estar vinculado as alterações que observamos na morfologia celular e na expressão de determinados receptores de membrana. Surpreendentemente, a fagocitose in vivo de L. interrogans por macrófagos da cavidade peritoneal foi maior em camundongos deficientes de C3. No entanto, ainda há necessidade de se acertar melhor as condições experimentais. Por fim, medimos a ação de ROS e ativação de MAPK em macrófagos de ambos os grupos de camundongos, após estímulo com 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA). Tais parâmetros foram menos intensos em macrófagos de B6.C3-/-, confirmando a importância de C3 para a sinalização celular, e merece ser mais amplamente estudado no futuro. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a presença de C3 durante o desenvolvimento ontogenético de camundongos C57Black/6 pode influenciar determinados parâmetros morfológicos e funcionais de macrófagos, células estas de fundamental importância para a resposta imune inata e adquirida.

Leptospirosis is an important zoonosis for public health, caused by the spirochete bacteria of the genus Leptospira . The innate immune response against these bacteria depends largely on phagocytosis and activation of the Complement System. This system is composed by several proteins that are either soluble or present on the cell surface, participating in both innate and adaptive immunity. C3 is the most abundant protein in this system and its importance is especially confirmed in C3 deficient patients, as they are very highly susceptible to severe and recurrent infections. Several studies have shown that the C3 protein plays a fundamental role in the control of infections, responsible for generating opsonins which facilitate microorganism killing, including leptospires. However, the role of C3 in leukocyte differentiation and intracellular response has not been investigated so far. To better understand the importance of C3 for the development of macrophages, this study aimed to compare several important cell parameters for phagocytosis of leptospires on macrophages of C57Bl/6 (wild) and C57Bl/6 C3-/- mice (C3 deficient). Initially, the cell populations in the peritoneal exsudate were assessed by flow cytometry. Higher number of resident macrophages (F4/80high) and lower number of macrophages differentiated from monocytes (F4/80low) were observed in C3 deficient mice, when compared to wild mice, suggesting that monocyte recruitment to the inflammatory site maybe is impaired. The cytoskeleton plays a crucial role in phagocytosis and is important for migration and formation of cell evaginations and invaginations which allow particle internalization. Considering that, the presence and distribution of -tubulin and F-actin in peritoneal macrophages and bone marrow derived macrophages was analyzed. The absence of C3 significantly interfered in macrophage morphology and size, since they stained less with anti--tubulin and reduced cell size (area), evidenced by the use of phalloidin (reacts with F-actin). Then, the presence of the following cell surface molecules was quantified by flow cytometry: CD11a /CD18, CD11b, CD11c, CD64, CD197, CD206, CD282, CD284, CD36, CD80, MHC II and CD21/CD35. The presence of the following receptors CD282 (TLR2), CD64 (FcR1) and CD36 (scavenger receptor) was approximately 20% less in bone marrow differentiated macrophages from C3 deficient mice, when compared to macrophages from wild mouse strain. However, the presence of these same receptors was similar in peritoneal macrophages from both groups of mice. On the other hand, the presence of the Complement 4 receptor (CR4; CD11c / CD18) was six times higher in peritoneal macrophages and differentiated from the bone marrow of B6.C3-/- We also evaluated the phagocytosis of Zimosan and E. coli K12, which was higher in B6.C3-/- macrophages, which may be linked to the cell morphology changes and expression of certain membrane receptors. No significant difference in the in vitro phagocytosis of leptospires by murine macrophages was observed. However, it is still necessary to improve the experimental conditions. Surprisingly, the in vivo phagocytosis of L. interrogans by peritoneal macrophages was higher in C3 deficient mice. Finally, we measured ROS and MAPK activation in macrophages, after 12-O-tetradecanoylforbol-13-acetate (TPA) treatment. Both were less intense in B6.C3-/- macrophages compared to B6.C3+/+ macrophages, confirming the importance of C3 for cell signaling which remains to be further investigated. Taken together, our results suggest that C3 may influence morphology and macrophage functions during ontogeny of C57Black/6 mice, which is of great importance for innate and acquired immune responses.