A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa causada por bactériaspertencentes ao complexo M. tuberculosis. A pneumonia exacerbada com áreasnecróticas e infiltrados granulocíticos caracteriza algumas das formas graves de TBque acomete não apenas crianças e indivíduos imunocomprometidos, mas tambémpessoas infectadas com cepas de alta virulência. Embora os granulócitos contribuamna resposta do hospedeiro contra infecções bacterianas, seu papel na progressão dadoença grave é ainda controverso. Além disso, um importante mecanismo envolvidona regulação do recrutamento de granulócitos na TB se dá através da expressão dogene Irg1 e produção do itaconato. Portanto, compreender as vias moleculares queinduzem a expressão do gene Irg1 é um importante passo para entender a etiologiadas formas graves de TB. Considerando esses aspectos, este estudo foi subdivido emduas partes: a) avaliar o papel das células mieloides supressoras (MDSCs) naprogressão da TB grave causada pela cepa hipervirulenta MP287/03 (Mycobacteriumbovis), em camundongos C57BL/6; e b) investigar os mecanismos moleculares pelosquais a Mycobacterium tuberculosis induz a expressão do gene Irg1 em macrófagosmurinos. Em relação à TB causada pelas micobactérias MP287/03, observamos umadiminuição da massa corpórea, bem como uma piora da patologia pulmonar do dia 21ao 28 pós-infecção (p.i.). Durante este período, as células CD11b+GR1int acumularamprogressivamente na medula óssea, sangue e pulmão, sugerindo que elas sãooriginadas na medula óssea e migram para o pulmão através da corrente sanguínea. Enquanto as células CD11b+GR1high e CD11b+GR1int nos controles eramrespectivamente neutrófilos (Ly6G+Ly6Clow) e monócitos (Ly6G-Ly6Chigh), a populaçãoCD11b+GR1int em camundongos infectados com a cepa hipervirulenta apresentaramexpressão intermediária de Ly6G e Ly6C e granulosidade semelhante à neutrófilos. Essa população também expressou marcadores de células mieloides imaturas comoCD117 (c-KIT), CD124 (IL-4Rα) e CD135 (Flt-3). Além disso, as células CD11b+GR1+ da medula óssea de animais infectados com a cepa hipervirulenta suprimiram aproliferação de linfócitos T CD4+ e CD8+, assim como a produção de IFN-γ. Asupressão de linfócitos T in vivo foi evidenciada pela diminuição da produção de IFN-γ e IL-17 no pulmão do dia 28 p.i. comparado com o dia 21 p.i., enquanto que aprodução de IL-10 estava aumentada. A expressão de PD-L1 em altos níveis nasuperfície das MDSCs parece ser um dos mecanismos envolvidos naimunossupressão. Para eliminar as MDSCs, camundongos infectados com a cepahipervirulenta, já apresentando perda da massa corpórea, foram tratados com oanticorpo monoclonal anti-GR1. Uma redução na carga bacteriana e na inflamaçãopulmonar, bem como aumento na produção de IFN-γ e na sobrevida dos animais, foiobservada nos camundongos tratados com anticorpo anti-GR1. Esses resultadoscomprovam que as MDSCs induzem imunossupressão e, consequentemente,agravam a doença causada por micobactérias hipervirulentas. A cerca do mecanismo envolvido na indução da expressão do gene Irg1 pela M. tuberculosis, nósobservamos a participação parcial da via de sinalização do TLR2-MyD88-NFkB. Alémdisso, ensaios utilizando substâncias inibidoras revelaram que a fagocitose e aacidificação do fagossomo são importantes para a resposta a micobactérias, mas nãoa LPS ou PAM3CSK4. Interessantemente, nós mostramos que a indução da respostado Irg1 causada pelas micobactérias é também dependente da molécula bacterianaESAT-6 e das vias de sinalização do macrófago STING e interferon do tipo I (IFN-I). Baseado nesses achados nós hipotetizamos que as micobactérias induzem aexpressão do gene Irg1 através da interação de 2 vias: 1) indução de NFkBdependente de TLR2-MyD88 presumidamente na superfície da célula do hospedeiroe 2) um sinal amplificador crítico estimulado pela fagocitose e dependente da liberaçãono citosol mediada por ESAT-6 de produtos bacterianos com consequente ativaçãode STING e produção de IFN-I. Juntos, os dados obtidos nesse estudo contribuempara uma maior compreensão da imunopatologia da TB e abre perspectivas para odesenvolvimento de novas abordagens terapêuticas que visam atenuar a gravidadeda doença.

Extensive pneumonia with necrotic areas and granulocyticinfiltrates characterizes some of the aggressive forms of TB that affects not onlychildren and immunocompromised individuals, but also individuals infected with highvirulencestrains. Although granulocytes contribute to the early immune responseagainst TB, their role in progression of severe disease is still controversial. In addition,an important mechanism involved in regulating the granulocyte recruitment in TBoccurs through Irg1 expression and itaconate production. Therefore, understandingthe molecular mechanisms that induce Irg1 expression is an important step tounderstand the etiology of severe forms of TB. Considering these aspects, this studywas subdivided in two main branches: a) to assess the role of myeloid-derivedsuppressor cells (MDSCs) in the progression of severe TB caused by hypervirulentMP287/03 (Mycobacterium bovis) in C57BL/6 mice; and b) to investigate the molecularpathways by which Mycobacterium tuberculosis (Mtb) triggers Irg1 gene expression inmurine macrophages. Regarding TB caused by MP287/03 mycobacteria, a decreasein body weight, as well as a worsening of the pulmonary pathology, was observed fromday 21 to 28 post-infection (p.i.). During this period, CD11b+GR1int cells progressivelyaccumulated in the bone marrow, blood and lungs, which suggests that they originatein the bone marrow and migrate into the lungs through blood stream. While lungCD11b+GR1high and CD11b+ GR1int cells in controls were respectively the neutrophils(Ly6G+Ly6Clow) and monocytes (Ly6G-Ly6Chigh), the CD11b+GR1int population inMP287/03-infected mice showed intermediate Ly6G and Ly6C expression andgranularity similar to neutrophils. These cells also expressed the immature myeloid cellmarkers CD117 (c-kit), CD124 (IL-4R) and CD135 (Flt-3). Moreover, bone marrowCD11b+GR1+ cells from hypervirulent strain infected mice suppressed CD4+ and CD8+ T cell proliferation and IFN-γ production. T cell suppression in vivo was evidenced bydecreased IFN-γ and IL-17 production in the lungs at day 28 p.i. compared to day 21p.i., while IL-10 production was increased. The high levels of PD-L1 expression onMDSCs surface seem to be one of the mechanisms involved in theimmunosuppression. To eliminate MDSCs, MP287/03-infected mice already showingweight loss were treated with anti-GR1 monoclonal antibodies. A reduction in thepulmonary bacterial load and inflammation, as well as increased IFN-γ production andprolonged mouse survival, was observed in anti-GR1 treated mice. These results showthat MDSCs induce immunosuppression and consequently aggravate the diseasecaused by hypervirulent mycobacteria. Regarding the mechanism involved in theinduction of Irg1 gene expression by M. tuberculosis, we observed a partial role for theTLR2-MyD88-NFkB signaling pathway. In addition, assays using inhibitory drugsrevealed a major requirement for phagocytosis and endosomal acidification in theresponse to mycobacteria, but not to LPS or PAM3CSK4. Importantly, we found thatthe Irg1 response induced by mycobacteria is also highly dependent on bacterialESAT-6 and the macrophage signaling pathways mediated by STING and Type 1interferon (IFN-I). Based on these findings, we hypothesize that mycobacteria induceIrg1 expression in macrophages via two interacting triggers: 1) TLR2-MyD88dependent NFkB induction presumably at the host cell plasma membrane and 2) acritical amplifying signal stimulated by phagocytosis and dependent of ESAT-6-mediated release into the cytosol of bacterial products with consequent STINGactivation and IFN-I production. Together, the data obtained in this study contribute toa better understanding of the immunopathology of TB and opens perspectives for thedevelopment of new therapeutic approaches that aim to mitigate the severity of thedisease.