Integrinas αvβ3 e IIbβ3 promovem a interação entre plaqueta-melanoma e melanomamicroambiente. A insularina (GST-INS) é uma disintegrina recombinante que inibe as integrinas αIIbβ3 presentes na superfície das plaquetas, e αvβ3 presentes em células endoteliais e tumorais. Essas integrinas participam dos mecanismos de metástase e invasão tumoral. Assim, o objetivo deste trabalho foi verificar o papel das membranas plaquetárias (MP), utilizando como modelo de estudo células de melanoma humano SK-MEL-28 (ME), além de verificar a ação da GST-INS, nesses eventos. Para isso em placas de cultura com Matrigel foram adicionadas às células ME ou HUVECs, prétratadas com GST-INS, GST ou Aggrastat®, na presença de MP. Para o ensaio de invasão tumoral, utilizou-se o transwell onde as células ME foram pré-incubadas com as mesmas proteínas, na presença de MP por 48 hs. Para o ensaio de competição, células ME foram pré-tratadas com GST-INS e adicionadas à placa sob componentes da matriz ou com colágeno I na forma íntegra, ou desnaturada por pH ou termicamente. Nossos resultadosmostraram que célulasME ouHUVECs tratadas pela MP, apresentam uma morfologia migratória em relação as células não estimuladas. Diferentemente, em amostras incubadas com GST-INS, as células ME ou células HUVECs foram incapazes de formar túbulos. Além disso, células ME incubadas com MP tornaram-se mais invasivas. Porém, GST-INS inibiu a capacidade de invasão dessas células ao Matrigel. Já no ensaio de competição com diferentes ligantes da matriz extracelular a GST-INS também foi capaz de inibir a adesão de ME ao fibrinogênio e ao colágeno tipo I. Ao comparar a adesão de células ME ao colágeno I na forma íntegra ou desnaturada, a GST-INS apresentou maior inibição na adesão de ME ao colágeno desnaturado. Tal resultado, provavelmente é decorrente do fato de que o colágeno desnaturado expõe a sequência RGD, reconhecida pelas integrinas αvβ3,15 diferentemente do colágeno íntegro, onde a sequência RGD não é acessível. Entretanto, a incubação das ME com MP estimularam a adesão celular ao colágeno íntegro, sugerindo a liberação de MMPs pelas células estimuladas, hidrolisando o colágeno e, consequentemente expondo o sítio de ligação, favorecendo a adesão das ME ao colágeno íntegro. Os ensaios de expressão gênica, demonstraram que células ME incubadas com MP apresentam maior expressão de MMP-9, Ang-2 e TGF-β, em relação a expressão das células ME não estimuladas por MP. Por outro lado, GST-INS modulou negativamente a expressão desses genes, mesmo na vigência do estímulo com MP, o que explicaria a inibição dos eventos avaliados. Assim, o bloqueio simultâneo da integrina deMP, αIIbβ3 e da integrina v3 pela GST-INS impede o contato de MP com as células ME ou HUVECs, importantes para a vasculogênese, angiogênese, adesão à matriz extracelular e para a invasão tumoral. Além disso, a inibição dos eventos estudados é suportada pela modulação negativa da GST-INS na expressão de genes relacionados a fenótipos pró-metastáticos como Ang-2, MMP-9 e TGF-β. Dessa forma, a GST-INS torna-se uma potencial ferramenta para o desenvolvimento de antagonistas de integrinas que atuem na progressão tumoral dependente de plaquetas.

Integrins αvβ3 and αIIbβ3 promote the interaction between platelet-melanoma and melanoma-microenvironment. Insularin (GST-INS) is a recombinant disintegrin that inhibits αIIbβ3 integrins present on the surface of platelets, and αvβ3 present in endothelial and tumor cells. These integrins participate in the mechanisms of metastasis and tumor invasion. Thus, the objective of this work was to verify the role of plateletmembranes (PM), using humanmelanoma cells SK-MEL-28 (ME) as a study model, in addition to verifying the action of GST-INS in these events. For this, culture plates with Matrigel were added to ME cells or HUVECs, pretreated with GST-INS, GST or Aggrastat® , in the presence of PM. For the tumor invasion assay, the transwell was used where the ME cells were pre-incubated with the same proteins, in the presence of PM for 48 hs. For the competition assay, ME cells were pretreated with GST-INS and added to the plate under matrix components or with collagen I in full form, or denatured by pH or thermally. Our results showed that ME cells or HUVECs stimulated by PMpresent a migratory morphology in relation to non-stimulated cells. In differently, in samples incubated with GST-INS, ME cells or HUVEC cells were unable to form tubules. In addition, ME cells incubated with PM have become more invasive. However, GST-INS inhibited the ability of these cells to break into matrigel. In the competition assay with different extracellular matrix ligands, GST-INS was also able to inhibit the me's adhering to fibrinogen and type I collagen. This result is probably due to the fact that denatured collagen exposes the RGD sequence, recognized by v3 integrins, unlike intact collagen, where the RGD sequence is not accessible. However, the incubation of ME with MP stimulated cellular adhering to intact collagen, suggesting the release of MMPs by stimulated cells, hydrolysing collagen and, consequently exposing the binding site, favoring the adhering of ME to 17 intact collagen. Gene expression assays demonstrated thatME cells incubatedwithMP present higher expression of MMP-9, Ang-2 and TGF-β, in relation to the expression of ME cells not stimulated by PM. On the other hand, GST-INS negatively modulated the expression of these genes, even in the presence of the stimulus with PM, which would explain the inhibition of the evaluated events. Thus, the simultaneous blockade of PMintegrin, αIIbβ3 and integrin αvβ3 by GST-INS prevents PMcontact withME or HUVECs cells, important for vasculogenesis, angiogenesis, extracellular matrix adeation and tumor invasion. In addition, inhibition of the studied events is supported by negativemodulation of GST-INS in the expression of genes related to prometastatic phenotypes such as Ang-2, MMP-9 and TGF-β. Thus, GST-INS becomes a potential tool for the development of antagonists that act on platelet-dependent tumor progression.