O CD3 é um conjunto de cadeias proteicas não-covalentemente associadas às cadeias do receptor das células T (TCR). O complexo CD3 é essencial para a ativação dos linfócitos T e até para a correta expressão do seu TCR na superfície celular. O complexo TCR-CD3 é alvo de várias imunoterapias focadas na regulação da atividade dessas células. Anticorpos monoclonais (mAbs) anti-CD3 possuem grande potencial no tratamento de doenças autoimunes (diabetes mellitus I, doenças inflamatórias do intestino), na indução de tolerância em transplantes alogênicos e na imunoterapia oncológica (anticorpos bi-específicos). O mAb anti-CD3 produzido por hibridoma murino possui limitações de uso terapêutico pela indução de reações adversas como proliferação de células T e secreção de citocinas pró-inflamatórias. Para evitar problemas associados à imunogenicidade das moléculas não-humanas, alguns mAbs anti-CD3 passaram por humanização. como o Otelixizumab, Visilizumab, Teplizumab. O uso experimental de mAbs anti-CD3 humanizados tem sido associado a um aumento de linfócitos T reguladores (Treg) e de citocinas relacionadas com um perfil imunorregulador. Para testar o potencial imunorregulador de um anti-CD3 humanizado a partir de um hibridoma reclonado no Instituto Butantan, este trabalho propõe a avaliação da atividade imunorreguladora induzida por mAbs anti-CD3 humanizados através de ensaios in vitro. Os genes das cadeias leve e pesada da molécula humanizada in silico foram clonados em vetor pCHO e transfectados em células CHO-S. Os clones foram avaliados pela produtividade, crescimento celular e ligação ao CD3 humano. Para os ensaios de ligação por ressonância plasmônica de superfície (SPR) foi expresso um antígeno humano CD3 gama-épsilon. O gene do antígeno recombinante foi construído por DNA assembly e expresso em Escherichia coli. O perfil de ligação dos anticorpos humanizados é mais baixo do que aquele visto com o anti-CD3 murino, o que indica uma menor afinidade da molécula humanizada. Dos 280 clones de anti-CD3 umanizado, foram selecionados alguns para os ensaios funcionais in vitro com PBMC humano, além do pool estável pré-clonagem. Por citometria de fluxo a taxa de proliferação de dois clones avaliados foi mais baixa do que a induzida por tratamento com o anti-CD3 murino em ambas as concentrações testadas (1 e 5 g/mL). O tratamento com o anticorpo humanizado aumentou a subpopulação de células T CD4+ e diminuiu o CD8+ em relação ao murino. A subpopulação de Treg (CD4+ CD127-CD25highFoxp3+ ) aumentou com o tratamento humanizado, ao inverso do mesmo com o anticorpo murino. O perfil de citocinas/quimiocinas (48h/192h) para o tratamento com o anti-CD3 murino foi altamente inflamatório no tempo de 48h na avaliação do sobrenadante e nos tempos de 24 e 72 h no ensaio de marcação intracelular. Os clones humanizados presentaram um perfil próximo ao controle não tratado na avaliação dessas citocinas. Entretanto, o estudo das citocinas intracelulares apresentou um aumento dos granulócitos nos grupos tratados com o anticorpo humanizado, sendo que esses grupos não apresentaram um aumento na produção de IFN-γ e TNF-α. Estes dados contribuem para a compreensão da cinética do anti-CD3 humanizado, apesar de não conclusivos. Mais estudos são necessários nas possíveis construções do anti-CD3 humanizado (monoespecíficos, biespecíficos etc.).

CD3 is a protein chain set non-covalently associated with TCR. The CD3 complex is essential to T cell activation even to the correct TCR expression on the cell surface. TCR-CD3's chains are targets for immunotherapies that focus on the regulation of the T cell´s activity. Monoclonal antibodies (mAbs) anti-CD3 have the potential to treat autoimmune diseases (diabetes mellitus I, inflammatory bowel diseases), host-vs-graft disease prevention or reversion, and câncer immunotherapy (bispecific antibodies). Production of the murine anti-CD3 mAb by hybridoma has therapeutics limitations associated with its capacity to cause adverse reactions like T cell proliferation induction and pro-inflammatory cytokines secretion. To overcome those issues also associated with non-human molecules immunogenicity, some anti-CD3 mAbs were humanized like Otelixizumab, Visilizumab, Teplizumab. The experimental usage of humanized anti-CD3 mAbs has been associated with an increase of regulatory T lymphocytes (Treg) and immunoregulatory cytokines. To test the immunoregulatory potential of the humanized anti-CD3 from a murine hybridoma recloned at Butantan Institute, this study aims to evaluate in vitro the regulatory activity of clones of humanized anti-CD3 mAbs. The humanized molecule light and heavy chains genes were cloned into pCHO vector, then transfected into CHO-S. The clones were ranked by their specific productivity, cellular growth, and human CD3 binding capacity. For the binding assay by surface plasmonic resonance (SPR) we used an in-house recombinant antigen of the human CD3 gamma-epsilon. The recombinant antigen was made by DNA assembly technique and expressed in E. coli in inclusion bodies, then solubilized and in vitro refolded. The binding capacity of the humanized anti-CD3 was lower in comparison to the murine molecule, it indicates a low affinity of the humanized anti-CD3. From 280 clones expressing the humanized anti-CD3, some were selected for the in vitro functional assays with human PBMC. By flow cytometry, the proliferation rate induced by two clones was lower than that induced by the murine anti-CD3 treatment at two concentrations, 1 e 5 g/mL. The treatment with the humanized antibody increased the CD4+ subpopulation and decreased CD8+ cells in relation to the murine version. The Treg (CD4+ CD127-CD25highFoxp3+) subpopulation was increased when the humanized mAb was added and decreased with the murine antibody treatment. The secreted cytokine profile (48 h/192 h) due to the murine anti-CD3 treatment was highly inflammatory at 48 h and at 24 and 72 h in the intracellular assay. However, the two humanized clones showed a profile close to the non-treated group. The intracellular cytokines assay shows more granulocytes with humanized anti-CD3, and no IFN-γ e TNF-α were produced by those group of cells. These data contribute to the understanding of the humanized anti-CD3, although not conclusive. More studies are necessary for the possible constructions of the humanized anti-CD3 (monospecific, bispecific etc.).