Camundongos geneticamente selecionados para máxima (AIRmax) e mínima (AIRmin) resposta inflamatória aguda têm sido empregados em diversos estudos sobre fatores genéticos envolvidos no processo de inflamação. A partir de análises de associação e um sinal de linkage altamente significativo (LOD score = 72) entre SNPs e fenótipos de AIR avaliados durante a seleção e a produção de IL-1 ß , foi delimitada uma região em 128Mb (intervalo de 3.5Mb) no cromossomo 7, denominado locus Irm1. Após sequenciamento desta região, observou-se que PYCARD, responsável por codificar a proteína adaptadora ASC o qual é essencial no processamento de IL-1 ß e IL-18 após a ativação de inflamassomas, estava entre os genes que apresentaram polimorfismo. O objetivo deste estudo é é caracterizar a influência da mutação encontrada no gene PYCARD através da produção de IL-1 ß por macrófagos nestes animais. Para isso, após estímulos como LPS e ATP, medimos os níveis de IL-1 ß secretada por ELISA e, enquanto AIRmax produz altos níveis de IL-1 ß , em AIRmin foram dosados níveis baixos ou a citocina não foi detectada. Após genotipagem, observamos que, em AIRmax, os alelos do gene PYCARD estão fixados em homozigose, mas AIRmin ainda apresentava polimorfismo. Através de acasalamentos assistidos por genotipagem, produzimos sublinhagens de AIRmin que expressam genótipos diferentes de PYCARD (CC, CT, TT) e vimos que esta variação genotípica não interferiu na modulação da resposta inflamatória aguda ao Biogel, uma vez que a diferença fenotípica de AIR se manteve, ou na produção de citocinas inflamatórias como IL-6, IP-10 e IFN-ϒ. No entanto, ao dosarmos os níveis de IL-1 ß após ativação de diferentes inflamassomas, como NLRP3, NLRC4 e AIM2, vemos que a variação genotípica influencia na produção da citocina, uma vez que AIRmaxCC e AIRminCC liberaram altos níveis de IL-1 ß , enquanto em AIRminTT a citocina não foi detectada. Também houve um aumento na quantificação das proteínas pró- IL-1 ß e ASC em BMDMs de AIRmaxCC e AIRminCC estimulados para ativação do NLRP3. Observamos também uma queda significativa no número de células viáveis em AIRmaxCC após ativação por LPS + ATP, o que não ocorreu nas sublinhagens de AIRmin. Além disso, utilizando um substrato fluorométrico (YVAD-AFC), analisamos a atividade da Caspase-1 e vimos que esta é significativamente menor em animais AIRmin homozigotos para o alelo mutado. Por microscopia confocal e citometria de fluxo (HCS e AMNIS) conseguimos demonstrar a formação de ASC specks e a presença de GSDMD e caspase-1 ativa no citosol celular após ativação do NLRP3 em mácrofagos AIRmaxCC e em AIRminCC, este último com menor frequência. Já em AIRminTT não foi posível identificar a formação dos specks ou um aumento significativo na quantidade de GSDMD. Nossos resultados sugerem que a troca de aminoácidos, ocasionada pelo polimorfismo de ocorrência natural encontrado em AIRmin, interfere na formação do agregado de moléculas ASC, provocando uma perda de habilidade da proteína de ativar diferentes tipo de inflamassoma. Além disso, a mutação não parece influenciar a produção de outras citocinas inflamatórias, onde podemos observar ainda uma grande influência do background genético heterogêneo das linhagens AIR.

Mice genetically selected for maximum (AIRmax) and minimum (AIRmin) acute inflammatory response have been used in several studies on genetic factors involved in the inflammation process. Based on association analyzes and a highly significant linkage signal (LOD score = 72) between SNPs and AIR phenotypes evaluated during selection and IL-1 ß production, a 128Mb region (3.5Mb range) was delimited in the chromosome 7, called the Irm1 locus. After sequencing this region, it was observed that PYCARD, responsible for encoding the ASC adapter protein, which is essential in the processing of IL-1 ß and IL-18 after inflammasome activation, was among the genes that showed polymorphism. The objective of this study is to characterize the influence of the mutation found in PYCARD gene through the production of IL-1 ß by macrophages in these animals. For this, after stimuli such as LPS and ATP, we measured the levels of IL-1 ß secreted by ELISA and, while AIRmax produces high levels of IL-1 ß , in AIRmin low levels were measured or the cytokine was not detected. After genotyping, we observed that, in AIRmax, PYCARD gene alleles were fixed in homozygosis, but AIRmin still showed polymorphism. Through genotyping-assisted matings, we produced AIRmin sublines that express different PYCARD genotypes (CC, CT, TT) and we saw that this genotypic variation did not interfere in the modulation of the acute inflammatory response to Biogel, since the phenotypic difference in AIR was maintained, or in the production of inflammatory cytokines such as IL-6, IP-10 and IFN-ϒ. However, when measuring IL-1 levels after activation of different inflammasomes, such as NLRP3, NLRC4 and AIM2, we see that genotypic variation influences cytokine production, since AIRmaxCC and AIRminCC released high levels of IL-1 ß , while in AIRminTT the cytokine was not detected. There was also an increase in the quantification of pro- IL-1 ß and ASC proteins in AIRmaxCC and AIRminCC BMDMs stimulated for NLRP3 activation. We also observed a significant drop in the number of viable cells in AIRmaxCC after activation by LPS + ATP, which did not occur in AIRmin sublines. Furthermore, using a fluorometric substrate (YVAD-AFC), we analyzed Caspase-1 activity and found that it is significantly lower in AIRmin animals homozygous for the mutated allele. By confocal microscopy and flow cytometry (HCS and AMNIS) we were able to demonstrate the formation of ASC specks and the presence of GSDMD and active caspase-1 in the cell cytosol after NLRP3 activation in AIRmaxCC and AIRminCC macrophages, the latter less frequently. In AIRminTT, however, it was not possible to identify the formation of specks or a significant increase in the amount of GSDMD. Our results suggest that the amino acid exchange, caused by the naturally occurring polymorphism found in AIRmin, interferes with the formation of the aggregate of ASC molecules, causing a loss of the protein's ability to activate different types of inflammasomes. Furthermore, the mutation does not seem to influence the production of other inflammatory cytokines, where we can still observe a great influence of the heterogeneous genetic background of the AIR lineages.