O fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2) é considerado uma proteína chave no desenvolvimento do melanoma, sendo responsável por desempenhar papel importante no crescimento do tumor, angiogênese e metástase. O anti-FGF2 3F12E7,um anticorpo monoclonal (mAb) murino, foi previamente obtido por colaboradores e mostrou ser uma estratégia antitumoral promissora para melanoma, quando testado em camundongos. Considerando o potencial terapêutico do mAb anti-FGF2 3F12E7, somado à limitação do uso deste anticorpo murino em humanos, neste trabalho tivemos como objetivo a humanização deste anticorpo utilizando a tecnologia de phage display para a obtenção, pela técnica de seleção guiada, de anticorpos humanos correspondentes ao mAb murino anti-FGF2 3F12E7. Para o processo de humanização foram construídas três bibliotecas de fragmento de ligação ao antígeno (Fab): murino, híbrido e humano. As técnicas de phage display, panning, phage ELISA e ELISA foram realizadas, em cada etapa da humanização, para a seleção de Fab com afinidade pelo antígeno recombinante FGF2 (rFGF2). A construção da biblioteca Fab murino foi realizada a partir do hibridoma anti-FGF2 3F12E7. O gene Fd (região variável e primeiro domínio constante da cadeia pesada VH+CH1) do clone murino com maior ligação ao rFGF2 por ELISA foi clonado em vetor contendo a biblioteca de genes de cadeia leve (LC) humanos para a construção da biblioteca Fab híbrido. Os genes LC humanos de três clones híbridos selecionados por ELISA foram clonados em vetor contendo a biblioteca de genes Fd humanos para a construção das bibliotecas Fab humano. Os clones Fab humanos selecionados com afinidade pelo rFGF2 apresentaram stop códon na sequência da LC, apesar de possuírem sequências Fd funcionais. A estratégia de seleção guiada utilizada não possibilitou a seleção de clones Fab humanos funcionais, porém resultou na seleção de LC e Fd humanas funcionais. Seguiu-se para a estratégia de clonar as regiões variáveis das LC e Fd humanas em vetores AbVec (contendo os genes da região constante da LC e HC de imunoglobulina humana) e combinar cada uma das 3 LC com as 8 HC humanas selecionadas para expressão de IgG completos por cotransfecção transitória em células HEK293-F. Dos 20 anticorpos expressos, 7 mostraram ligação ao rFGF2 por ressonância plasmônica de superfície (SPR). A atividade funcional desses 7 anticorpos foi avaliada através de ensaios in vitro de proliferação e migração celular utilizando células endoteliais humanas (HUVEC) e células de melanoma humano (SKMel-28). Os anticorpos humanos anti-FGF2 62K98H e 85L117H foram capazes de reduzir, de forma significante, o número de células viáveis e de atenuar a migração celular, nas duas linhagens celulares, em comparação ao controle negativo (IgG irrelevante), resultado próximo ao observado anteriormente com o anticorpo murino anti-FGF2 3F12E7 utilizado como modelo para a humanização.

Fibroblast growth factor 2 (FGF2) is considered a key protein in melanoma development, and is responsible to play an important role in tumor growth, angiogenesis and metastasis. The anti-FGF2 3F12E7, a murine monoclonal antibody (mAb), was previously obtained by collaborators, showing a promising antitumor strategy for melanoma, when tested in mice. Considering the therapeutic potential of anti-FGF2 3F12E7 mAb, as well as its limited use in humans due to its murine origin, the aim of this study was its humanization using phage display technology to obtain, by guided selection technique, human antibodies corresponding to the murine anti- FGF2 3F12E7 mAb. For the humanization process, three libraries of fragment antigen binding (Fab) were constructed: murine, hybrid and human. The phage display, panning, phage ELISA and ELISA techniques were performed, in each step of humanization, for the selection of a Fab with affinity to recombinant FGF2 antigen (rFGF2). Construction of the murine Fab library was derived from the anti-FGF2 3F12E7 hybridoma. The Fd gene (variable region and first constant domain of the heavy chain VH+CH1) from the murine clone with the highest binding to rFGF2 by ELISA was cloned into the human light chain (LC) gene library to construct the hybrid Fab library. The human LC genes from three hybrid clones selected by ELISA were cloned into the human Fd gene library to construct the human Fab libraries. The selected human Fabs with affinity to rFGF2 resulted in clones showing stop codon in the LC sequence, despite the functional Fd sequences. The guided selection strategy used did not produce functional human Fab clones, however it resulted in the selection of functional human LC and Fd. The next strategy was the cloning of the human LC and Fd variable regions into AbVec vectors (containing the constant region genes of LC and HC human immunoglobulin) and combining each one of the 3 LC with the 8 HC selected for IgG expression by transient co-transfection into HEK293-F cells. Out of 20 antibodies expressed, 7 showed binding to rFGF2 by surface plasmon resonance (SPR). The functional activity of these 7 antibodies was evaluated through in vitro cell proliferation and migration assays using human endothelial cells (HUVEC) and human melanoma cells (SK-Mel-28). The human anti-FGF2 antibodies 62K98H and 85L117H were able to significantly reduce the number of viable cells and to attenuate cell migration, in both cell lines, compared to negative control (irrelevant IgG), a result close to that previously observed with the murine anti-FGF2 3F12E7 mAb used as a template for the humanization process.