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Tesis Doctoral
DOI
https://doi.org/10.11606/T.42.2019.tde-02102019-152220
Documento
Autor
Nombre completo
Cristiane Naffah de Souza Breda
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
São Paulo, 2019
Director
Tribunal
Câmara, Niels Olsen Saraiva (Presidente)
Alves Filho, José Carlos Farias
Festuccia, William Tadeu Lara
Negro, Sonia Jancar
Silva, Fabiano Pinheiro da
Título en portugués
Importância do complexo 2 da via mTOR (mTORC2) nas funções efetoras e no metabolismo dos neutrófilos em modelo experimental de SEPSE
Palabras clave en portugués
Imunometabolismo
mTORC2
Neutrófilos
Sepse
Via mTOR
Resumen en portugués
Os neutrófilos são importantes células do sistema imune inato e a primeira linha de resposta durante um processo inflamatório. Suas propriedades e funções, assim como seu metabolismo, bastante estudados no passado ganharam uma nova perspectiva com o advento de uma nova área do conhecimento: o imunometabolismo. Com isso, o estudo da via metabólica mTOR se evidenciou nas células imunes. Porém, a participação dessa via nas funções efetoras e no metabolismo dos neutrófilos ainda é pouco esclarecida. De maneira mais restrita, a importância do complexo mTORC2 nessas células é ainda menos explorada, pois não há um inibidor específico desse complexo. Sabendo-se que a via mTOR se conecta com a via PI3K pela quinase AKT, formulamos a hipótese de que a deleção de mTORC2 prejudicaria as funções efetoras dos neutrófilos, uma vez que a PI3K é importante para a quimiotaxia, fagocitose, degranulação e para o burst oxidativo dos neutrófilos. Dessa forma, usando animais deficientes ou não em mTORC2 ativado (LysMRic/ ou LysMRic fl/fl) apenas nas células mieloides, nós investigamos o papel desse complexo sob as funções efetoras e o metabolismo dos neutrófilos. Além disso, verificamos o impacto dessa deleção em modelo experimental de sepse. Ao avaliarmos o estado de ativação da via mTOR, observamos que o estímulo com LPS é capaz de ativar mTORC2 e que a ausência de mTORC2 ativo nos neutrófilos diminui a fosforilação da AKTT308 frente ao LPS. Quanto às funções efetoras dos neutrófilos, verificamos que a ausência de mTORC2 ativo prejudica a quimiotaxia frente ao fMLP, mas não aparenta interferir na capacidade fagocítica dessas células. No entanto, a capacidade microbicida está reduzida nesses neutrófilos. Identificamos que o prejuízo no killing da E. coli é devido a uma menor produção de NO, superóxido e, principalmente, HOCl. Possivelmente, a menor produção de HOCl tenha sido responsável também pela menor produção de NETs nos neutrófilos sem mTORC2 ativo. Ao avaliarmos o metabolismo desses neutrófilos, observamos que na ausência de mTORC2 os neutrófilos são mais glicolíticos frente aos estímulos com fMLP ou LPS, porém a captação de glicose desses neutrófilos é menor quando comparada ao controle com a via intacta. Posteriormente, o impacto da deficiência de mTORC2 em neutrófilos foi avaliado in vivo em modelo de sepse induzida por E. coli . Neste caso, não observamos diferença na sobrevida dos animais, mas os parâmetros bioquímicos e da calorimetria indireta sugerem um quadro de sepse mais grave nos animais LysMRic/. Além disso, a carga bacteriana nos órgãos-alvo da sepse foi maior nos animais LysMRic/, corroborando nossos achados in vitro . Assim, concluímos que a deficiência de mTORC2 nos neutrófilos implica em uma menor produção de oxidantes, principalmente o HOCl, o que leva a um prejuízo na capacidade microbicida e na formação das NETs nesses neutrófilos.
Título en inglés
Role of mTOR complex 2 (mTORC2) in the neutrophils effector function and metabolism during a sepsis model
Palabras clave en inglés
Immunometabolism
mTOR pathway
mTORC2
Neutrophils
Sep
Resumen en inglés
Neutrophils are the first line of defense in the innate arm of the immune system. Their functions and metabolism were well explored in the past. However, a new research field, the immunometabolism, brought new perspectives to neutrophils functional properties. Besides, the metabolic pathway mTOR, also became spotlighted with the immunometabolism emergence. Nevertheless, the role of mTOR pathway, mainly the mTORC2, in neutrophils is not clear. It is well known that mTOR pathway is linked to PI3K via AKT. Therefore, we hypothesized that the mTORC2 deletion in neutrophils would impair their effector functions once PI3K is important to neutrophils chemotaxis, phagocytose, degranulation and oxidative burst. In this sense, we used a myeloid-specific Rictor deleted mice (inactive mTORC2) to investigate the role of mTORC2 in neutrophils effector functions and metabolism. Moreover, we evaluated the impact of Rictor deletion in a mouse sepsis model. We observed that LPS can activate mTORC2 and the absence of active mTORC2 decreases the AKTT308 phosphorylation upon LPS stimulation. We demonstrated that inactive mTORC2 impairs neutrophils chemotaxis upon fMLP stimulation, and apparently does not interfere with its phagocytic capacity. However, the neutrophils microbicidal capacity is clearly compromised due to an impairment in NO, superoxide, but mainly in HOCl production. Possibly, the decrease in HOCl production affected the NETs formation. Regarding the neutrophils metabolism, we observed that when mTORC2 is absent the neutrophils are more glycolytic upon fMLP or LPS stimulation, but their glucose uptake is lower than the active mTORC2-neutrophils. After, we investigated the impact of the Rictor deletion in a E. coli-induced sepsis model. Although we did not see statistic difference in the survival curve, the glycemia, urea and indirect calorimetry suggest a poor sepsis outcome in the LysMRic/ animals. Besides, the bacterial burden was increased in the LysMRic/, corroborating our in vitro results. Therefore, we conclude that mTORC2 absence in neutrophils implies in a decrease in oxidants production, mainly HOCl, leanding to an impairment in the microbicidal capacity and NETs formation.
 
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Fecha de Liberación
2021-10-01
Fecha de Publicación
2019-11-19
 
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