As Escherichia coli extraintestinais (ExPEC) fazem parte da microbiota intestinal humana, mas podem causar doença ao acessar um sítio extraintestinal. Este patógeno é um dos principais causadores das infecções de corrente sanguínea (ICS), uma vez que utiliza diversas estratégias para evasão dos mecanismos da imunidade inata encontrados no sangue, como o sistema complemento. Dentre elas, destacam-se dois membros da família das Serino Proteases Autotransportadoras de Enterobacteriaceae (SPATEs), denominadas Pic e EspP, cujas ações proteolíticas sobre o complemento já foram demonstradas. Porém, altas frequência do gene sat (que codifica a SPATE Sat) têm sido detectadas em cepas de E. coli isoladas de bacteremia, fato que sugere o envolvimento desta SPATE na patogênese das ICS. Sat já foi caracterizada quanto à sua ação citotóxica sobre diferentes linhagens celulares, incluindo células endoteliais, mas sua possível ação imunomodulatória ainda não foi investigada. Diante dessas evidências, o presente trabalho se propôs a avaliar o papel de Sat na patogênese das ICS e da sepse causada por E. coli. Inicialmente, uma coleção de 278 cepas de E. coli isoladas de bacteremia humana foi analisada quanto a presença de 12 genes que codificam SPATEs (eatA, epeA, espC, espI, espP, pet, pic, sat, sepA, sigA, tsh e vat). Dentre eles, sat foi o mais frequente, sendo detectado em 34,2% das cepas. Para continuidade do trabalho, a cepa EC071 foi selecionada desta coleção por não possuir outros genes que codificam SPATEs além de sat. Seu genoma foi sequenciado e a presença de outros genes relacionados à resistência ação bactericida do complemento, como genes de proteínas de membrana externa (ompTc, ompTp e ompX) e a protease Prc foram detectados. Ensaios de resistência à ação bactericida do soro humano normal mostraram que a cepa EC071 resiste a essa atividade. A protease Sat foi purificada em sua forma nativa a partir do sobrenadante de cultura da cepa EC071 e utilizada em ensaios proteolíticos contra as proteínas do sistema complemento. As proteínas C2, C3, C3b, C4, C4b, C5, C6, C7, C8 e C9 foram clivados por Sat e essas clivagens foram inibidas por fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF), um inibidor de serinoproteases. Um mutante em sat e mutantes complementados com o gene funcional ou não funcional foram obtidos a partir da EC071 e avaliados quanto a resistência à ação bactericida do soro. No entanto, não houve diferença significativa no fenótipo apresentado pelas construções em relação a cepa selvagem, indicando que Sat não é o único fator responsável por este fenótipo. Em um modelo murino de sepse, observou-se a redução de 50% nas mortes dos animais infectados pela cepa mutante em relação aos infectados pela cepa selvagem e a complementação de Sat funcional na cepa mutante restaurou parcialmente o efeito observado na cepa selvagem. Os resultados aqui apresentados mostram que Sat está envolvida no estabelecimento das ICS e da sepse e que, além de desempenhar efeitos citotóxicos, pode conferir também proteção contra o sistema imune do hospedeiro por meio da clivagem direta de proteínas do sistema complemento.

Extraintestinal Escherichia coli (ExPEC) are part of the human intestinal microbiota but can cause disease when accessing extraintestinal sites. This pathogen is one of the main causes of bloodstream infections (BSI) due to several strategies used to evade the mechanisms of innate immunity found in the blood, such as the complement system. Among them, two members of the Serine Proteases Autotransporters of Enterobacteriaceae (SPATEs) family, named Pic and EspP, have been described presenting proteolytic effects against complement proteins. However, high frequencies of sat, which encodes the SPATE Sat, have been detected in strains of E. coli isolated from bacteremia, a fact that suggests the involvement of this SPATE in the pathogenesis of BSI. Sat has already been characterized for its cytotoxic action on different cell lines, including endothelial cells, but its possible immunomodulatory effects have not yet been investigated. Considering these evidences, the present study aimed to evaluate the role of Sat in the pathogenesis of BSI and sepsis caused by E. coli. Initially, a collection of 278 strains of E. coli isolated from human bacteremia was analyzed for the presence of 12 SPATEs-encoding genes. Among them, sat was the most frequent, detected in 34.2% of the strains. The strain EC071 was selected among that collection to continue the study due to the absence of other SPATEs-encoding genes that encode besides sat. Its whole genome was sequenced, and the presence of other genes related to resistance to the bactericidal action of the complement, such as genes coding outer membrane proteins (ompTc, ompTp e ompX) and the Prc protease were detected. Assays of resistance against the bactericidal action of normal human serum showed that the EC071 strain could resist to that activity. The protease Sat was purified in its native form from the culture supernatant of EC071 and used in proteolytic assays against proteins of the complement system. The proteins C2, C3, C3b, C4, C4b, C5, C6, C7, C8 and C9 were cleaved by Sat and these cleavages were inhibited by phenylmethylsulfonyl fluoride, a serine protease inhibitor. A mutant in sat and mutants complemented with the functional or non-functional sat gene were obtained from EC071 and tested for resistance against the bactericidal action of the normal human serum. However, there was no significant difference in the phenotype presented by the constructions in comparison to the wild-type strain, indicating that Sat is not the unique factor responsible for this phenotype. In a murine sepsis model, a 50% reduction in deaths of the animals infected by the mutant strain was observed in relation to those infected by the wild-type strain and the complementation of functional sat in the mutant strain partially restored the effect observed in the wild strain. The results presented in this study show that Sat is involved in the establishment of BSI and sepsis and in addition to the cytotoxic effects, it can also provide protection against the immune system of the host by the direct cleavage of proteins of the complement system.