A butirosina é um aminoglicosídeo produzido por Bacillus circulans que apresenta um grupo (S)-4-amino-2-hidroxibutirato (AHBA) ligado à aglicona 2-deoxiestreptamina (2-DOS). A presença do grupo AHBA é capaz de diminuir a suscetibilidade do antibiótico às enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (EMAs) produzidas por bactérias patogênicas. Porém, a biossíntese do grupo AHBA é pouco compreendida. Com a intenção de entender a biossíntese desse grupo, estudamos estruturalmente duas enzimas desta via: a BtrJ que catalisa a ligação de uma molécula de L-glutamato com a holo-BtrI, uma proteína carreadora de peptidil (PCP); e a BtrK que descarboxila o intermediário da reação anterior. As enzimas foram super expressas em células competentes de E. coli e posteriormente purificadas por cromatografia de afinidade e exclusão molecular. Foram realizados ensaios de cristalização mediante as técnicas de difusão de vapor para as proteínas nativas e em presença do sus cofatores. Obtivemos cristais da BtrK e BtrJ que foram difratados em fonte de luz Síncrotron. Os cristais da BtrK pertencem ao grupo espacial P2₁2₁2. A estrutura da BtrK foi determinada mediante substituição molecular. Estruturalmente, a BtrK apresenta dois domínios: um barril TIM e um barril β sanduíche que interagem entre si. A dimerização acontece pela interação de domínios entre dois monómeros constituindo dois sítios ativos. Um resíduo de lisina Lys49 conservado forma uma base Schiff com o cofator piridoxal-5-fosfato (PLP). O sítio ativo é altamente conservado quando comparado com enzimas homólogas, sendo principalmente hidrofóbico e com um potencial eletropositivo. De acordo com os ensaios de ancoragem molecular, o L-glutamato, substrato parcial da BtrK, não interage diretamente com o PLP, mas faz ligações com resíduos próximos que podem ajudar na sua estabilização no bolsão catalítico. Não foi possível detectar um sinal anômalo derivado da incorporação de metais pesados para a BtrJ, mas obtivemos cristais promissores com incorporação de selenometionina. Mediante ensaios de DSF, pudemos inferir a necessidade de holo-BtrI para a formação de um complexo estável com a BtrJ.

Butirosin is an aminoglycoside produced by Bacillus circulans which has a (S)-4-amino-2-hydroxybutyrate (AHBA) moiety bonded to a 2-deoxystreptamine (2-DOS) aglycone. The presence of AHBA decreases the antibiotic susceptibility to aminoglycoside modifying enzymes (AMEs) produced by pathogenic bacteria. However, the several points of the biosynthesis of AHBA remain unclear. With the objective to understand the biosynthesis of this chemical group, herein we perform a structural study of two enzymes of this pathway: BtrJ which catalyses the bounding of a L-glutamate molecule with the holo-BtrI, a peptidyl carrier protein (PCP); and BtrK which decarboxylates the intermediary of BtrJs reaction. The enzymes were overexpressed in E. coli competent cells and purified by affinity chromatography followed by size exclusion chromatography. Crystallization assays were performed through vapor diffusion technique for the proteins in their native conformations as well as in the presence of their cofactors. BtrK and BtrJ crystals were obtained and were exposed to X-ray to obtain diffraction data in the Synchrotron light source. BtrK protein crystals belong to P2₁2₁2 space group. Phasing was done by molecular replacement and two domains were identified: one TIM barrel and another β-sandwich interacting between themselves. Dimerization occurs with the interaction of the domains between two monomers that constitutes two active sites. A conserved lysine Lys49 residue forms a Schiff base with pyridoxal-5-phosphate (PLP) cofactor. Active site is highly conserved when compared to homologous enzymes, being mostly hydrophobic and electropositive. According to the molecular docking assays, L-glutamate, partial BtrKs substrate, does not interact directly with the PLP, but bonds with nearby residues that can aid stabilize it in the catalytic pocket. It was not possible to identify an anomalous scattering from the heavy metal soaking for BtrJ crystals, however, we obtained promising crystals with selenomethionine incorporation. Through DSF experiments, we inferred the need for holo-BtrI for the formation of a stable complex with BtrJ.