Thèse de Doctorat
DOI
https://doi.org/10.11606/T.42.2023.tde-16062023-103202
Document
Auteur
Nom complet
Orlando Bonito Scudero
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2023
Directeur
Jury
Ventura, Armando Morais (Président)
Coltri, Patricia Pereira
Kobarg, Jörg
Pierulivo, Enrique Mario Boccardo
Titre en portugais
Envolvimento da proteína M2-2 do Vírus Sincicial Respiratório Humano com as maquinarias de tradução e splicing celulares
Mots-clés en portugais
splicing
eiF2α
grânulos de stress
M2-2
proteassomo
puromicina
RSV
tradução
vírus sincicial respiratório
Resumé en portugais
O vírus sincicial respiratório humano (hRSV) é um vírus envelopado de RNA fita simples com polaridade negativa não segmentada, integrante da família Pneumoviridae, ordem Mononegavirales. Durante a infecção, as proteínas virais N, P e L formam corpúsculos de inclusão citoplasmáticos onde ocorrem os eventos de transcrição e replicação do RNA viral. Nestes eventos, as proteínas M2-1 e M2-2 atuam como cofatores da polimerase viral L, sendo responsáveis por regular suas atividades de transcriptase e replicase. Além de suas funções relacionadas ao ciclo replicativo, o envolvimento de N, P, L e M2-1 com proteínas celulares já foi explorado, fornecendo informações sobre as estratégias utilizadas pelo vírus durante a infecção, bem como possíveis alvos inibitórios. Contudo, até o presente momento não foram desenvolvidos estudos semelhantes investigando o papel regulatório de M2-2. Neste trabalho, foi investigada a relação de M2-2 com a maquinaria celular e quais funções a proteína desempenha na célula. Na busca de proteínas parceiras em ensaios de coimunoprecipitação seguida de análise por espectrometria de massas, foram identificados interagentes envolvidos com a tradução e enovelamento de proteínas, além de componentes do spliceossomo. Em acordo com esses resultados, foi verificado que a expressão de M2-2 inibe a iniciação da tradução celular, o que resulta na modulação negativa da fosforilação de eiF2α e inibição de grânulos de stress. Também foi identificado que a proteína colocaliza com produtos defectivos de ribossomo no citoplasma, sendo alvo de degradação via proteassomo em células humanas. Corroborando os dados de proteômica, verificou-se que a expressão da proteína também promove mudanças na morfologia de speckles nucleares, sítios onde ocorre a maturação dos transcritos celulares. Por fim, a observação de bandas duplicadas para a proteína levou a identificação da formação de homodímeros pela mesma, o que é dependente das duas cisteínas presentes na sua porção amino-terminal. Em conjunto, esses dados descrevem funções até então desconhecidas para a proteína M2-2, o que pode contribuir para a melhor compreensão de como a proteína auxilia o vírus a subverter a maquinaria celular em prol de sua replicação.
Titre en anglais
Involvement of the M2-2 protein from the Respiratory Syncytial Virus with the translation and splicing cellular machineries
Mots-clés en anglais
eiF2α
M2-2
proteasome
puromycin
respiratory syncytial virus
RSV
splicing
stress granules
translation
Resumé en anglais
The human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) is an enveloped, single-stranded, negative RNA virus belonging to the order Mononegavirales family Pneumoviridae. During infection, the viral proteins N, P and L are assembled into cytoplasmic inclusion bodies, sites where transcription and replication of the RSV genome takes place. In these events, the proteins M2-1 and M2-2 act as cofactors of the polymerase L, being responsible for the regulation of its transcriptase and replicase activities. Beyond their functions related to replication, the involvement of N, P, L and M2-1 with cellular proteins has been broadly explored, providing information on the strategies utilized by the virus to facilitate infection, as well as potential inhibitory targets. However, until now, similar studies investigating the regulatory role of M2-2 have not been developed. In this work, it was investigated the relationship of M2-2 with the cellular machinery and what functions the protein performs in the cell. Trying to identify potential partners of the protein in coimmunoprecipitation assays followed by mass spectrometry analysis, interactors involved with translation and protein folding were found, in addition to spliceosome components. In line with these results, it was shown that the expression of M2-2 inhibits translation initiation, which results in downregulation of eiF2α phosphorylation and inhibition of stress granules. It was also identified that the protein colocalizes with defective ribosomal products in the cytoplasm, being targeted for proteasome degradation in human cells. In accordance with the proteomic data, it was verified that the expression of M2-2 also promotes changes in the morphology of nuclear speckles, sites where the maturation of cellular transcripts occurs. Finally, the observation of duplicated bands for the protein led to the characterization of its ability to form homodimers, which is dependent on the two cysteines present in its amino-terminal portion. Together, these data describe previously unknown functions for the M2-2 protein, which may contribute to a better understanding of how this protein helps the virus to subvert the cellular machinery in favor of its replication.
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Date de Libération
2025-06-15
Date de Publication
2023-06-19
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