Espécies patogênicas de Leptospira são extremamente eficientes quanto à disseminação e propagação no hospedeiro, fato atribuído à capacidade que possuem de escapar da ação do sistema complemento, primeira linha de defesa da resposta imune inata, e também à capacidade de degradar componentes da matriz extracelular e do plasma humano. A secreção de proteases que inativam proteínas do hospedeiro é uma importante ferramenta utilizada por diversos microrganismos durante o processo de colonização. Os mecanismos subjacentes ao dano tecidual causado por leptospiras patogênicas ainda são pouco conhecidos. Assim como outras bactérias, leptospiras atravessam barreiras epiteliais e endoteliais para ter acesso aos órgãos. Adesão e degradação de componentes da matriz extracelular, principalmente da membrana basal, são certamente necessárias para invasão. Recentemente, nosso grupo avaliou a atividade proteolítica de proteínas secretadas por leptospiras, e uma análise do exoproteoma dessas bactérias permitiu a identificação de algumas proteases, dentre as quais a metaloprotease pappalysin-1 domain protein, à qual denominamos leptolisina. Neste projeto produzimos e caracterizamos funcionalmente a leptolisina de L. interrogans visando ampliar o conhecimento sobre essa metaloprotease de Leptospira nos processos de invasão e evasão imune. Análises in silico mostraram que esta protease pertence à categoria das short pappalysins, também encontradas em outras bactérias. A leptolisina está presente em todas as espécies de Leptospira analisadas, mas é mais conservada entre as espécies patogênicas do subclado P1. Uma caracterização bioquímica preliminar da atividade proteolítica desta protease foi realizada usando peptídeos FRET (Free Ressonance Energy Transfer). A enzima exibiu atividade máxima em pH 8,0 e 37oC, foi ativa na presença de diferentes sais e fortemente inibida por EDTA e 1,10-fenantrolina. Apresentou acentuada preferência por resíduos de arginina na posição P1. A ação proteolítica da leptolisina recombinante sobre moléculas do hospedeiro foi também avaliada in vitro e in vivo. A metaloprotease apresentou atividade sobre proteínas da matriz extracelular (proteoglicanas e fibronectina), moléculas da cascata de coagulação (fibrinogênio e trombina) e proteínas efetoras do sistema complemento humano (C2 a C9). Em um modelo de inoculação da proteína em pele dorsal de camundongos, observaram-se hemorragias e degradação de fibronectina extraída da pele. No que diz respeito aos impactos produzidos pela protease na coagulação, plasma humano tratado com doses elevadas da proteína deixou de coagular. Análises da microcirculação por microscopia intravital (modelo do músculo cremaster) apontaram um aumento no número de leucócitos rolantes na presença de leptolisina, e observou-se agregação leucocitária dependente de tempo. Uma cepa nocaute de leptolisina (Δlic13434) foi produzida e caracterizada. Esta cepa apresentou menor sobrevivência em soro humano normal (SHN), comparada à cepa selvagem. No entanto, em um modelo de infecção epicutânea em hamsters, não se observou atenuação da virulência com a cepa nocaute, embora a carga bacteriana nos rins destes animais tenha sido inferior àquela observada nos animais inoculados com a cepa selvagem. Por fim, dados com soros de pacientes com leptospirose são sugestivos de que há produção de leptolisina durante infecções naturais por leptospiras patogênicas. A caracterização de toxinas, seus alvos e mecanismos de ação podem auxiliar no desenvolvimento de estratégias para combater a leptospirose.

Pathogenic Leptospira species are extremely efficient in disseminating in the host, a fact attributed to their ability to escape complement system activation - the first line of defense of the innate immune response - and also to the ability to degrade extracellular matrix and other components of the human plasma. The secretion of proteases that inactivate host proteins is an important tool used by various microorganisms during the colonization process. The mechanisms underlying tissue damage caused by pathogenic leptospires are still poorly understood. Like other bacteria, leptospires cross epithelial and endothelial barriers to gain access to organs. Adhesion to and degradation of extracellular matrix components, especially the basement membrane, are certainly required for invasion. Recently, our group evaluated the proteolytic activity of secreted proteins by leptospires, and exoproteome analyzes of these bacteria allowed the identification of some proteases, including the metalloprotease pappalysin-1 domain protein, which we named leptolysin. In this work we produced and functionally characterized leptolysin from L. interrogans in order to expand our knowledge on this metalloprotease from Leptospira in the processes of invasion and immune evasion. According toin silico analyzes this protease belongs to the category of short pappalysins, also found in other bacteria. Leptolysin is present in all Leptospira species, but is more conserved among pathogenic species of the P1 subclade. A preliminary biochemical characterization of its proteolytic activity was performed using FRET (Free Resonance Energy Transfer) peptides. The enzyme exhibited maximum activity at pH 8.0 and 37oC, was active in the presence of different salts and was strongly inhibited by EDTA and 1,10-phenanthroline. It showed a marked preference for arginine residues in the P1 position. The proteolytic activity of recombinant leptolysin on host molecules was also evaluated in vitro and in vivo. The metalloprotease was active against extracellular matrix proteins (proteoglycans and fibronectin), coagulation cascade molecules (fibrinogen and thrombin) and effector proteins of the human complement system (C2 to C9). In mice dorsal skin leptolysin caused hemorrhages and degradation of skin fibronectin. With regard to the impacts produced by the protease on coagulation, human plasma treated with high doses of the protein failed to clot. Analyzes of the microcirculation by intravital microscopy (cremaster muscle model) showed an increase in the number of rolling leukocytes in the presence of leptolysin, and time-dependent leukocyte aggregation was observed. A leptolysin knockout strain (Δlic13434) was produced and characterized. This strain showed lower survival in normal human serum (SHN) compared to the wild-type strain. However, in a model of epicutaneous infection in hamsters, no attenuation of virulence was observed with the knockout strain, although the bacterial load in the kidneys of these animals was lower than that observed in animals inoculated with the wild-type strain. Finally, data with sera from leptospirosis patients suggest that leptolysin is produced during natural infections by pathogenic leptospires. The characterization of toxins, their targets and mechanisms of action can help in the development of strategies to combat leptospirosis.