A cárie dental é uma doença infecciosa com ampla distribuição mundial que tem como principal agente etiológico o Streptococcus mutans (S. mutans). Apesar dos esforços para desenvolvimento de uma vacina, não há disponível no mercado um produto para a utilização em humanos. O presente trabalho tem como objetivo o estudo de estratégias vacinais de mucosa utilizando novos alvos vacinais: a proteína GlnH e duas regiões da proteína P1 localizadas nas porções N-terminal e C-terminal, compreendendo as proteínas recombinantes P1_39-512 e P3C, respectivamente. A proteína GlnH é o componente ligante de glutamato/glutamina dos transportadores do tipo ABC, relacionada com a expressão de fatores associados à virulência. Os genes sintéticos, que codificam para a proteína GlnH completa (GlnHco) e dois fragmentos derivados dela: região N-terminal (nGlnH) e C-terminal (cGlnH), foram desenhados de forma a adaptar o uso de códons para a expressão em Bacillus subtilis (B. subtilis). e remoção do sítio de ligação ao substrato. Esses genes foram subclonados no vetor pHT08 e as proteínas, expressas pelas linhagens recombinantes de B. subtilis. Todas as proteínas apresentaram mobilidade alterada em gel de poliacrilamida, mesmo após serem submetidas a diferentes tratamentos com agentes desnaturantes/dissociativos. A ausência de alteração na mobilidade eletroforética após os tratamentos sugeriu que as proteínas se apresentavam como monômeros e que, possivelmente, o fenômeno seria decorrente da composição de aminoácidos das proteínas. Por fim, foi feita a purificação da proteína GlnHco e geração de soros policlonais para a utilização em ensaios de imunodetecção. Os anticorpos séricos gerados em camundongos imunizados com rGlnH interferiram na adesão de bactérias à cavidade bucal de camundongos não imunizados desafiados com S. mutans. Além disso, os camundongos ativamente imunizados com rGlnH foram parcialmente protegidos da colonização oral após o desafio com a cepa S. mutans NG8. Portanto, nossos resultados indicam que a proteína rGlnH de S. mutans é um potencial antígeno-alvo capaz de induzir respostas protetoras de anticorpos após administração sublingual. A P1 de S. mutans é a principal proteína envolvida na adesão bacteriana à superfície dental e, consequentemente, ao desenvolvimento da cárie dentária. As duas regiões de ligação à saliva (SBR) têm sido estudadas como alvos vacinais, mas não a comparação ou combinação entre elas. Neste estudo também avaliamos o potencial de uma abordagem vacinal baseada na administração intranasal e empregando as proteínas recombinantes P1_39-512 e P3C, isoladas ou em associação. Além disso, monitoramos pela imunoassinatura dos anticorpos gerados a resposta individual dos animais protegidos. Inicialmente, clonamos, expressamos e purificamos com sucesso a proteína P3C na linhagem recombinante de B. subtilis. A P3C recombinante preservou a região de ligação à saliva e, em associação com a P1_39-512, não restaurou a estrutura tridimensional complexa que pode mascarar os epítopos inibidores de aderência importantes. Após a imunização intranasal, observamos níveis mais elevados de anticorpos antígeno-específicos quando na presença do adjuvante LTK63, quer com as proteínas isoladas ou em combinação. A coadministração das duas proteínas mostrouse deletéria e reduziu os níveis de anticorpos gerados contra o sítio de ligação N-terminal, mas não contra o fragmento C-terminal. Respostas imunológicas protetoras foram observadas apenas em animais imunizados com a proteína P1_39-512. Os animais imunizados com a proteína P3C tiveram um discreto aumento na colonização de S. mutans quando comparados ao grupo controle. Com a tecnologia de imunoassinatura, foi possível distinguir animais protegidos de animais não protegidos, mesmo entre animais do mesmo grupo. Ao final, aplicamos a assinatura protetora para identificar qual animal estaria protegido da colonização por S. mutans. Em resumo, demonstramos que o uso do sítio de ligação à saliva N-terminal tem maior potencial para proteger os animais contra colonização pelo patógeno oral S. mutans.

Dental caries is an infectious disease with a worldwide distribution and the main etiological agent is Streptococcus mutans. Despite efforts to develop a vaccine, a product for human use is not available on the market. The present study aims to study mucosal vaccine strategies using novel vaccine targets: the GlnH protein and two fragments of the P1 protein located at the N-terminal and C-terminal portions of the protein, comprising the recombinant proteins P1_39-512 and P3C, respectively. The GlnH protein is the glutamate/glutamine linker component of the ABC transporter related with the expression of bacterial virulence factors. The synthetic genes encoding the complete GlnH protein (GlnHco) and two fragments derived from it: the N-terminal (nGlnH) and C-terminal (cGlnH), were designed after adaptation of the codon usage for expression in Bacillus subtilis and removal of the substrate binding site. These genes were subcloned into the pHT08 vector and the proteins expressed by recombinant B. subtilis strains. All proteins showed altered mobility on polyacrylamide gel, even after treatment with denaturing/dissociative agents. The lack of altered electrophoretic mobility of after the treatments suggested that the proteins were monomers and the phenomenon would be ascribed to the amino acid composition of the proteins. Finally, the GlnHco protein was purified and polyclonal sera were prepared for use in immunodetection assays. Serum antibodies raised in mice immunized with rGlnH interfered in bacterial adhesion to the oral cavity of naïve mice challenged with S. mutans. Moreover, mice actively immunized with rGlnH were partially protected to oral colonization after challenge with the S. mutans NG8 strain. Therefore, our results indicate that S. mutans rGlnH is a potential target antigen capable to induce protective antibody responses after sublingual administration. The P1 of S. mutans is the main protein involved in the bacterial adhesion to the dental surface and, consequently, to the onset of the dental caries. The two saliva binding regions (SBR) have been previously studied as vaccine targets, but not when combined. In this study we evaluated the potential of an intranasal vaccine approach using the recombinant P1_39-512 and P3C proteins, individually or in association, to control S. mutans oral colonization. Additionally, we monitored the individual immunosignatures of antibodies raised in protected animals. Initially, we successfully cloned, expressed, and purified P3C protein in recombinant strain B. subtilis. Recombinant P3C preserves saliva binding region and in mixed with P1_39-512 did not restore complex tridimensional structure which can masking important adherenceinhibiting epitopes. After the intranasal immunization, higher antibody levels were observed in the presence of the LTK63 adjuvant, either with each protein alone or in combination. Coadministration of both proteins proved to be deleterious and reduced the antibody levels to the N-terminal binding site but not for the C-terminal fragment. Protective immune responses were observed in animals immunized with P1_39-512. Animals immunized with P3C protein had a slightly increased S. mutans colonization when compared to the mock group. With the immunosignature technology, we could discriminate protected animals from non-protected animals even in the same vaccinated group. At end, we applied the protective signature approach to identify which animal would be protected from S. mutans colonization. In summary, we have demonstrated that the use of the N-terminal saliva-binding site had greater potential to protect animals against colonization by the oral pathogen S. mutans.