Transportadores do tipo ABC (do inglês ATP Binding Cassette), estão entre os principais complexos proteicos responsáveis pelo fluxo de moléculas contra um gradiente de concentração pela membrana plasmática. As funções atribuídas à esta família proteica vão desde o transporte per se, como nutrição, virulência, patogênese até resistência à drogas, em procariotos e eucariotos. Devido à pluralidade de funções, tais complexos têm sido alvo de extensos estudos para a compreensão do seu papel, funcional e estrutural, nos mecanismos de resistência. Transportadores ABC do tipo importadores, presentes somente em procariotos, são constituídos de duas permeases formadoras de um poro na membrana, duas ATPases que fornecem energia para a quebra do ATP e um componente adicional quando comparado aos exportadores, que é uma proteína ligadora de substrato responsável pela captura e entrega do substrato a ser transportado nas permeases na membrana. Esta interação é essencial e fundamental para a especificidade e velocidade do transporte, além de induzir mudanças conformacionais que ativam o transporte. Sem a interação da proteína ligadora, não há transporte. Baseados neste dado e no fato que importadores estão presentes somente em procariotos, este projeto visa definir um modelo de inibição dessses sistemas baseado na produção de anticorpos contra diferentes transportadores ABC das bactérias Escherichia coli e Staphylococcus aureus de forma a bloquear a interação entre permeases e proteínas ligadoras de substrato. Para tal, regiões de permeases que devem interagir com as proteínas ligadoras foram expressas utilizando o sistema Rad Display para posterior produção de anticorpos contra as mesmas. Neste sistema, as sequências de interesse foram extensivamente analisadas por bioinformática e posteriormente clonadas no interior do gene radA de Pyrococcus furiosus, sendo expressas como proteínas quiméricas sempre solúveis. As proteínas, doravante denominadas RAD-loops, foram então purificadas por meio de cromatografia de troca catiônica seguida de exclusão molecular e usadas para produção de anticorpos. Ensaios de ELISA indireto foram realizados para determinar o título de anticorpos nos soros de animais imunizados com as proteínas Rad+loop e, posteriormente, uma série de ensaios incluindo western blotting, whole cell elisa e imunofluorescência caracterizaram a interação dos anticorpos com seus respectivos alvos ABC. Por fim, foi realizado ensaio de inibição utilizando meio mínimo de crescimento na presença das igGs para determinar a influência das mesmas no crescimento bacteriano. Os resultados apresentados neste trabalho são de grande importância uma vez que são inéditos devido ao uso de permeases como alvo para inibição de ABCs, o que será extremamente relevante para o desenvolvimento de novas estratégias que visem bloquear ação desses complexos proteicos vitais para a manutenção da homeostase celular e vastamente disseminados tanto em procariotos como eucariotos.

ABC transporters (ABC binding cassette) are among the main protein complexes responsible for the traffic of molecules against a concentration gradient across the plasmatic membrane. The roles given to this protein family go from transport itself to nutrition, virulence, pathogenesis and even drug resistance, in prokaryotic and eukaryotic organisms. Due to its plurality of functions, they have been targets for several studies aiming the comprehension of its role, functional and structural, regarding the resistance mechanisms. ABC transporters from the importaçãors class, which are found only in prokaryotic organisms, are formed by two permease proteins that together create a pore in the membrane, two ATPase proteins that give the necessarity energy for the ATP breakdown and an additional component when compared to ABC exporters, which is a substrate binding protein responsible for the capture and delivery of the substrate to be transported by the permeases in the membrane. This interaction is essential and fundamental for the velocity and specificity of the transport, aside the fact that it induces conformational changes in the whole system that allows it to work properly. Without the interaction of the binding protein, there is no transport. Based in this assumption and on the fact that ABC importaçãors are present only in prokaryotic organisms, this project aims to define a model of inhibiton of this systems based on antibodies production against different ABC transporters from the bacteria Escherichia coli and Staphylococcus aureus in a way that blocks the interaction between the permeases and the substrate binding proteins. For this purpose, permease regions which are supposed to interact with the binding proteins were expressed utilizing the RAD display system and then used to produce antibodies against them. In this system, the interest sequences were extensively analyzed by bioinformatics and afterwards cloned inside the gene radA from Pyrococcus furiosus, being expressed as chimeric proteins, always exposed and soluble. The proteins now called pRAD-loops were then purified utilizing ion exchange chromatography and size exclusion chromatography and used for antibody production. Indirect ELISA assays were performed to determine the antibody titer in the serum of animals immunized with the Rad+loop proteins and afterward a series of assays including western blotting, whole cell elisa and immunofluorescence characterized the interaction between the antibodies with their respective ABC targets. Finally, it was performed an inhibition assay utilizing minimum media of growth on the presence of the IgGs. The results presented in this work are of great importance considering that it is the first the permeases are used as targets of ABCs inhibition, what is extremely relevant for the development of new strategies that aim blocking the action of these protein complexes vital for the cellular homeostasis and vastly disseminated among prokaryotes and eukaryotes.