Polihidroxialcanoatos (PHA) são poliésteres armazenados intracelularmente em diversas bactérias. Estes são sintetizados principalmente em condições de excesso de fonte de carbono e limitação de nutrientes essenciais, e degradados pela mobilização dos grânulos quando há escassez de carbono e/ou energia. O PHA mais conhecido é o poli-3-hidroxibutirato (P3HB). Sabe-se que a síntese de PHA depende principalmente das PHA sintases (PhaC), enquanto a mobilização ocorre pela ação das PHA despolimerases intracelulares (sendo PhaZa1 a de maior destaque). Um estudo anterior com linhagens recombinantes de Escherichia coli capazes de acumular P3HB demonstrou que a expressão simultânea dos genes lonA e phaZa1, de Ralstonia eutropha, resulta em altas taxas de mobilização do polímero previamente acumulado. Porém, não se observa mobilização expressiva quando um ou outro gene encontra-se isolado na célula. Surpreendentemente, a presença de LonA isoladamente na cepa recombinante de E. coli leva a um aumento significativo no acúmulo de P3HB intracelular, sugerindo que LonA desempenhe papel também na síntese do polímero. O presente trabalho avaliou o teor de P3HB em diferentes linhagens de E. coli (XL1-Blue, LS5218 e MG1655), capazes de acumular este polímero por meio de dois diferentes plasmídeos (pSK-::phaCAB e pJM9131), com e sem a presença do gene lonA, clonado no vetor pBBR1MCS-5. Nos cultivos realizados em agitador rotativo, todas as cepas analisadas apresentaram significante aumento das taxas de P3HB acumulados quando há expressão de lonA. A cepa recombinante de E. coli XL1-Blue abrigando o plasmídeo pJM9131 se mostrou mais eficiente no acúmulo do biopolímero quando lonA era expresso, atingindo mais de 65% da MSC, sendo esta cepa eleita para cultivos em biorreator. Os resultados dos cultivos em biorreatores indicam que a presença de LonA leve a uma alteração geral no metabolismo celular, favorecendo não apenas o acúmulo de P3HB, mas também o crescimento celular. Deste modo, LonA parece ter um efeito pleotrópico neste processo. Paralelamente a este trabalho, foram construídas linhagens de E. coli capazes de acumular P3HB, abrigando o gene phaP1, que codifica a PHAsina mais abundante na célula, e outra combinando os genes phaP1 e phaZa1. PHAsinas são proteínas que estão associadas à superfície dos grânulos de PHA, conferindo maior estabilidade aos mesmos. Alguns autores demonstram que a coexpressão de PHAsinas e PHA despolimerases intracelulares influencia na capacidade da célula de degradar o polímero intracelular. Desta forma, este trabalho buscou comparar o efeito de LonA e de PhaP1 no processo de mobilização de P3HB, através de cultivos in vivo e da tiólise dos grânulos in vitro. Os dados apresentados mostram que, embora ambas as proteínas avaliadas sejam importantes ativadores da mobilização em linhagens de E. coli, o efeito decorrente da presença de LonA é mais expressivo, sugerindo que essa enzima seja essencial para que a degradação ocorra. Os ensaios in vitro apontam ainda que LonA não seja uma proteína associada ao grânulo. Foi realizada a expressão e purificação das proteínas recombinantes LonA, PhaC e PhaZa1, individuais ou combinadas (LonA+PhaC e LonA+PhaZa1), em fusão com um peptídeo composto por múltiplos resíduos de histidina. Entretanto, não foi possível demonstrar uma interação direta pela copurificação de LonA com PhaC ou com PhaZa1. Todos os genes clonados neste trabalho foram obtidos a partir do genoma de R. eutropha.

Polyhydroxyalkanoates (PHA) are polymers stored intracellularly in several bacteria strains. PHA are synthetized mainly under conditions of carbon source excess and limitation of essential nutrients, and degraded by the granules mobilization when in carbon and/or energy starvation. The best known PHA is the poly-3-hydroxybutyrate (P3HB). It is known that the PHA synthesis depends mainly on PHA synthases (PhaC), while the mobilization occurs through the intracellular PHA depolymerase action (PhaZa1 being the most prominent). An earlier study using recombinant E. coli strains able to accumulating P3HB, shown that the simultaneous expression of lonA and phaZa1 genes, from Ralstonia eutropha, results in high rates of polymer mobilization. However, no significant mobilization was observed when only one gene was expressed in the cell. Surprisingly, the LonA presence singly in recombinant E. coli strain cause a significant increase in P3HB accumulation, suggesting that LonA also plays a role in polymer synthesis. This work evaluated the P3HB rates in different E. coli strains (XL1-Blue, LS5218 and MG1655), able to accumulate this polymer by two different plasmids (pSK-::phaCAB and pJM9131), with and without the lonA gene, cloned in pBBR1MCS-5 vector. In shake flasks cultures, all analyzed strains showed a significant increase in P3HB accumulation rates when lonA was expressed. The recombinant E. coli strain XL1-Blue, harboring pJM9131 plasmid, was shown to be more efficient in biopolymer accumulation with LonA presence, reaching more than 65% of DWC. This strain was selected to bioreactor assays. The results of cultures in bioreactors indicate that LonA presence cause a generalized alteration in cellular metabolism, favoring not only P3HB accumulation, but also the cellular growth. In this way, LonA appears to have a pleotropic effect in this process. Parallel to this work, E. coli strains able to accumulate P3HB, harboring the phaP1 gene, that encodes the most abundant PHAsin in the cell, and another combining phaP1 and phaZa1 genes, were constructed. PHAsins are protein that are associated with the surface of PHA granules, conferring more stability to them. Some authors demonstrated that the coexpression of PHAsins and intracellular PHA depolymerase influences the ability of cell degradation. Thus, this work aimed TO compare the LonA and PhaP1 effect in P3HB mobilization, through in vivo assay and in vitro granule thiolysis. The presented results show that, although both proteins evaluated are important activators of the mobilization in E. coli strains, the LonA effect is more expressive, suggesting that this enzyme is essential for the granules degradation to occur. In vitro assays indicate, that LonA is not a granules-associated protein. The expression and purification were accomplished in the recombinant proteins LonA, PhaC and PhaZa1, alone or combinate (LonA+PhaC and LonA+PhaZa1), in fusion with peptide of multiple histidine residues. However, it was not possible to demonstrate a direct interaction by the co-purification of LonA and PhaC or PhaZa1. All genes cloned in this work was obtained from R. eutropha genome.