Ortofosfato (Pi) é um dos macronutrientes mais abundantes na bactéria, sendo necessário para diversas funções celulares. Escherichia coli possui 3 sistemas de captação deste nutriente: PitA, PstSCAB-PhoU (Pst) e PhnCDE (Phn). Os dois últimos pertencem a um grupo de genes, conhecido como regulon PHO. Os genes deste regulon estão envolvidos em processos de captação e assimilação de Pi e e são regulados pelo sistema de dois componentes PhoB-PhoR. Mutações em qualquer um dos genes do operon pst e algumas mutações específicas em phoR causam a expressão constitutiva dos genes do regulon PHO. Essas mutações podem ser constituídas por substituições pontuais ou por inserções/deleções de base única ou de múltiplas bases. Mutantes que não regulam a expressão dos genes do regulon PHO são conhecidos como mutantes PHOconstitutivos. Tais mutantes podem ser selecionados em meio mínimo contendo glicerol-2-fosfato (G2P) como única fonte de carbono na presença de excesso de Pi. O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar genética e molecularmente mutantes PHO-constitutivos em cepas derivadas de E. coli K-12, e correlacionar as mutações com o nível de aptidão destes mutantes. Para isso, foram isolados 255 mutantes: 76 derivados da cepa selvagem MG1655, 40 derivados do mutante MG1655 ΔphnCDE, 72 derivados do duplo mutante ΔphnCDEΔpitA e 67 mutantes derivados da cepa MG1655 pitA::kan. Desses, 107 apresentaram grandes indels e os demais 148 mutantes portavam substituições ou pequenos indels; 90 mutações foram caracterizadas por sequenciamento e 148 tiveram o lócus da mutação identificado por meio de ensaios de complementação in trans. As mutações identificadas molecular e geneticamente ocorreram nos genes pstS (62%), pstC (9,8%), pstA (0,8%), pstB (22,3%) e phoR (5,1%). O nível de atividade da enzima fosfatase alcalina (FA), utilizada como repórter do nível de constitutividade do regulon PHO, foi medida em todos os mutantes. Os resultados sugerem que o nível de atividade da FA varia de acordo com o gene afetado, com o background genético da cepa ancestral e com o tipo de mutação.

Orthophosphate (Pi) is one of the most abundant macronutrients in bacteria, being necessary for several cellular functions. Escherichia coli carries 3 Pi uptake systems: PitA, PstSCAB-PhoU (Pst) and PhnCDE (Phn). The last two belong to the PHO regulon. The PHO regulon genes are involved in Pi metabolism and are controlles by the two-component system PhoB-PhoR. Mutations in any gene of the pst operon and some mutations in phoR cause the constitutive expression of the PHO regulon genes. These mutations may consist of single base substitutions, or indels of one or more bases. Mutants that do not repress the expression of the PHO regulon under Pi excess are known as PHO-constitutive mutants. Such mutants can be selected in minimal medium containing glycerol-2-phosphate (G2P) as the sole carbon source in the presence of Pi sufficiency. The objective of this work was to genetically and molecularly characterize PHO-constitutive mutants derived from E. coli K-12 derivatives and to correlate the mutations with the fitness level of these mutants. Thus far 255 mutants were isolated: 76 derived from the wild-type MG1655 strain, 40 derived from the MG1655 ΔphnCDE mutant, 72 derived from the double mutant ΔphnCDEΔpitA and 67 mutants derived from the MG1655 pitA::kan strain. One hundred and seven mutants carry large indels; while the remaining 148 hold point mutations or small indels. Ninety mutants characterized by sequencing the mutations and one hundred and forty-eight had the mutation locus identified through in trans complementation assays. The molecularly and genetically identified mutations occurred in the genes pstS (62%), pstC (9.8%), pstA (0.8%), pstB (22.3%) and phoR (5.1%). The enzymatic level of the alkaline phosphatase (AP), used as a reporter of the PHO regulon expression, was measured in all mutants. The results suggest that the constitutive activity of AP is correlated to the nature of the affected gene, the genetic background of the ancestral strain and the type of mutation.