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Tesis Doctoral
DOI
https://doi.org/10.11606/T.42.2020.tde-06012022-181045
Documento
Autor
Nombre completo
Henrique Iglesias Neves
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
São Paulo, 2020
Director
Tribunal
Spira, Beny (Presidente)
Baldini, Regina Lúcia
Galhardo, Rodrigo da Silva
Galvao, Teca Calcagno
Título en portugués
Estudo do surgimento de mutantes PHO-constitutivos em Escherichia coli.
Palabras clave en portugués
Escherichia coli
fosfatase alcalina
glicerol
glicerol-2-fosfato
regulon PHO
Resumen en portugués
O regulon PHO de Escherichia coli compreende o conjunto de genes cuja transcrição é diretamente regulada pela concentração do íon ortofosfato (Pi) no periplasma. Sua transcrição é controlada pelo sistema de dois componentes PhoB-PhoR e pelo transportador de Pi PstSCAB-PhoU. Mutantes PHO-constitutivos, que expressam os genes de PHO independente da concentração de Pi, podem ser selecionados em meios cuja única fonte de carbono é glicerol-2-fosfato (G2P). O crescimento dos mutantes é viabilizado pela hidrólise de G2P no periplasma, resultando em glicerol e Pi. a enzima responsável por essa reação - a fosfatase alcalina - é parte do regulon PHO e está expressa constitutivamente nos mutantes. O aparecimento de mutantes PHO-constitutivos segue um padrão semelhante ao encontrado para mutações adaptativas, que surgem após o contato com a pressão seletiva e novos mutantes se acumulam nas placas ao longo dos dias. Diferentemente de outros sistemas mutacionais, não são observados mutantes PHO-constitutivos pré-existentes e todos os mutantes surgem a partir do terceiro dia de incubação. Não há, porém, impedimento teórico para a ocorrência de mutações na pré-cultura. Na primeira parte deste trabalho, foi caracterizado o fenômeno relativo à ausência de mutações PHO-constitutivas precoces. É demonstrado que este fenômeno se deve à inibição de crescimento dos mutantes exercida pelas bactérias selvagens. Esta inibição depende da proximidade física entre as duas populações, sem necessidade de contato direto. A varredura de uma biblioteca de mutantes de E. coli indicou que, para que a inibição ocorra, as bactérias selvagens devem ser capazes de utilizar glicerol como fonte de carbono. Os resultados apontam para uma situação de tragédia dos comuns, onde o glicerol produzido pela hidrólise de G2P é consumido pelas bactérias selvagens antes que possa ser consumido pelos mutantes PHO-constitutivos. Em condições de baixa densidade de bactérias na placa seletiva, não ocorre inibição dos mutantes PHO-constitutivos. Neste caso foi possível calcular a real taxa de mutações PHO-constitutivas, que é da ordem de 2, 5 × 10-6 mutações/geração, estando dentro do esperado teórico para E. coli. Na segunda parte deste trabalho, foi caracterizado o sistema de transporte de fosfonatos, codificado por phnCDE. Um mutante espontâneo isolado em nosso laboratório, derivado de uma cepa ΔpitA ΔpstSCAB-phoU ΔugpBAEC apresentou a perda de uma inserção de 8 pb na ORF de phnE. Essa inserção é comum em derivados de E. coli K-12 e torna o transportador não funcional. Apesar de o mutante em questão portar deleções em todos os transportadores de Pi conhecidos, este conseguia crescer tendo Pi como única fonte de fósforo. Experimentos de crescimento e transporte de Pi mostraram que o sistema PhnCDE é, de fato, capaz de transportar Pi e o faz com uma eficiência similar à do transportador PitA.
Título en inglés
Study of emergence of PHO-constitutive mutants in Escherichia coli.
Palabras clave en inglés
Escherichia coli
alkaline phosphatase
glycerol
glycerol-2-phosphate
PHO-regulon
phosphonate
Resumen en inglés
The PHO-regulon of Escherichia coli comprises genes which transcription is regulated by the concentration of ortophosphate (Pi) in the periplasm. The transcription of PHO-genes is controlled by the two component system PhoB-PhoR and by the Pi transporter PstSCAB-PhoU. PHOconstitutive mutants, which express PHO genes regardless of Pi concentration, can be selected in media where the only carbon source is glycerol-2-phosphate (G2P). These mutants express large amounts of alkaline phosphatase, that hydrolyses G2P in the periplasm. The emergence of these mutants follows a pattern similar to that observed for adaptive mutations, i. e., they emerge after contact with the selective medium and keep accumulating thereafter. Unlike other mutational systems, pre-existing PHO-constitutive mutants are not observed and all mutants appear after the third day of incubation. However, there is no theoretical impediment to the occurrence of these mutations in the non-selective culture. The first part of this thesis describes the apparent absence of spontaneous PHO-constitutive mutations. We found out that this phenomenon is due to growth inhibition exerted by the wild-bacteria on the PHO-constitutive mutants, preventing their growth in the early days. This growth inhibition depends on physical proximity between the two populations, but physical contact is not required. Screening of a library of E mutants. coli indicated that for inhibition to occur, the inhibiting bacteria must be able to use glycerol as a carbon source. The results point to a "tragedy of commons" situation where the glycerol produced by G2P hydrolysis is consumed by wild-type bacteria before it could be taken up by the PHO-constitutive mutant. The actual rate of PHO-cinstitutive mutations is approximately 2, 5×10-6 mutations/generation, close to the general rate expected in E. coli. It was calculated in plates seeded with low bacteria density, a condition in which the growth of the PHO-constitutive mutant is not inhibited. In the second part of this work, the transport of Pi via the phosphonate transpor system encoded by PhnCDE was analysed. A spontaneous 8 bp deletion in the phnE ORF in the triple mutant ΔpitA ΔpstSCAB-phoU ΔugpBAEC was obtained. This insertion is common in derivatives of E. coli K-12 and inactvates transport through PhnCDE. Surprisingly, this strain could grow with Pi as the sole source of phosphorus. Growth and Pi uptake experiments showed that the PhnCDE system is indeed able to take up Pi with an efficiency similar to that of PitA.
 
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Fecha de Publicación
2022-01-13
 
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