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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.42.2021.tde-04032022-172441
Documento
Autor
Nome completo
Izadora de Souza Rezende
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2021
Orientador
Banca examinadora
Timenetsky, Jorge (Presidente)
Fraga, Ricardo Evangelista
Gregory, Lilian
Pierulivo, Enrique Mario Boccardo
Título em português
Análise da variabilidade genética e imunoinformática da glicosiltransferase de Ureaplasma diversum e sua relação com a constituição, antigenicidade e imunogenicidade do polissacarídeo capsular.
Palavras-chave em português
Ureaplasma diversum
Bioinformática
Cápsula
Glicosiltransferase
Imunogenicidade
Resumo em português
A economia do setor agro-industrial está diretamente relacionada à saúde dos rebanhos. A ocorrência de infertilidade, pode ser causada por micoplasmas e ureaplasmas, e pode levar a prejuízos. Ureaplasma diversum pode causar infecções e ativar a resposta imune e ativação de TLRs (Toll Like Receptors), bem como maturação de citocinas pró-inflamatórias. O recente sequenciamento do genoma de Ureaplasma diversum, permitiu aprimorar a compreensão da biologia molecular destas infecções e ampliar as possibilidades de desenvolvimento de novas alternativas diagnósticas e de prevenção. O objetivo deste estudo é avaliar a variabilidade genética e imunoinformática do gene da glicosiltransferase de U. diversum e sua relação com a constituição e antigenicidade e imunogenicidade do polissacarídeo capsular. Para tanto foi utilizada a cepa de referência de U. diversum ATCC 49782 e 52 isolados de swab vulvovaginal de bovinos. Foi realizada PCR para identificação do gene UD216, codificador da glicosiltransferase. Os amplicons foram sequenciados e construída uma árvore filogenética. As sequencias foram analisadas por meio de técnicas de bioinformática para predição de antigenicidade e características para expressão heteróloga. As análises de imuno e antigenicidade foram realizadas com cultura de PBMC bovinos. O ensaio de linfoproliferação foi feito por CFSE. Camundongos Balb/c foram usados para a produção de anticorpos policlonais. Foi avaliada a expressão gênica por qPCR de IL-1β, TNF-α, TLR2, TLR4 e iNOS. O nitrito foi dosado pelo método de Griess. Após a realização de PCR dos 52 isolados de U. diversum, 69% (n=36) foram positivas para o gene UD216, distribuidas nos diferentes estados brasileiros de coleta. Com o sequenciamento, as amostras formaram grupos de acordo com a proximidade gênica entre elas, compreendendo amostras coletadas em um mesmo lugar. As predições por bioinformática informaram que a sequência codificante do gene UD216 não possui características de antigenicidade mas tem capacidade de ligação a alelos de MHCI. As variações na sequencia e na composição de açúcares podem relacionar com mecanismos de variação antigênica e de escape a resposta imune. A presença do polissacarídeo capsular não induziu proliferação linfocitária em PBMC bovinos nem anticorpos específicos em camundongos. A expressão gênica de marcadores inflamatórios foi discreta, mas houve o aumento do nitrito nas culturas após a exposição ao CPS. Com os resultados obtidos será possível fomentar a discussão da importância e relevância do polissacarídeo capsular nas infecções por U. diversum, na reprodução e bovinocultura no cenário brasileiro e dar base para o desenvolvimento de ensaios diagnósticos e terapias mais eficientes.
Título em inglês
Analysis of the genetic and immunoinformatics variability of glycosyltransferase from Ureaplasma diversum and its relationship with the constitution, antigenicity and immunogenicity of the capsular polysaccharide.
Palavras-chave em inglês
Ureaplasma diversum
Bioinformatics
Capsule
Glycosyltransferase
Immunogenicity
Resumo em inglês
The economy of the agro-industrial sector is directly related to the health of the herds. The occurrence of infertility can be caused by mycoplasmas and ureaplasmas, and can lead to damage. Ureaplasma diversum can cause infections and activate the immune response and activation of TLR's (Toll Like Receptors), as well as maturation of pro-inflammatory cytokines. The recent sequencing of the genome of Ureaplasma diversum has improved the understanding of the molecular biology of these infections and expanded the possibilities for developing new diagnostic and prevention alternatives. The aim of this study is to evaluate the genetic and immunoinformatics variability of the glycosyltransferase gene from U. diversum and its relationship with the constitution and antigenicity and immunogenicity of the capsular polysaccharide. For this purpose, the reference strain of U. diversum ATCC 49782 and 52 isolates of vulvovaginal swab from bovines were used. PCR was performed to identify the UD216 gene, encoding the glycosyltransferase. Amplicons were sequenced and a phylogenetic tree constructed. The sequences were analyzed using bioinformatics techniques to predict antigenicity and characteristics for heterologous expression. Immunogenicity and antigenicity analyzes were performed with bovine PBMC cultures. The lymphoproliferation assay was performed by CFSE. Balb/c mice were used to produce polyclonal antibodies. Gene expression was evaluated by qPCR of IL-1β, TNF-α, TLR2, TLR4 and iNOS. Nitrite was measured using the Griess method. After PCR of the 52 U. diversum isolates, 69% (n=36) were positive for the UD216 gene, distributed in different brazilian states of collection. With the sequencing, the samples formed groups according to the genetic proximity between them, comprising samples collected in the same place. Bioinformatics predictions indicated that the coding sequence of the UD216 gene does not have antigenicity characteristics, but is capable of binding to MHCI alleles. Variations in the sequence and composition of sugars may relate to mechanisms of antigenic variation and immune response escape. The presence of capsular polysaccharide did not induce lymphocyte proliferation in bovine PBMC or specific antibodies in mice. Gene expression of inflammatory markers was discreet, but there was an increase in nitrite in cultures after exposure to CPS. With the results obtained, it will be possible to promote the discussion of the importance and relevance of the capsular polysaccharide in infections by U. diversum, in reproduction and cattle raising in the Brazilian scenario and provide a basis for the development of more efficient diagnostic tests and therapies.
 
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Data de Publicação
2022-12-02
 
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