Os protozoários do gênero Leishmania são os agentes etiológicos responsáveis pelas doenças conhecidas como leishmanioses que afetam milhões de pessoas em todo o mundo. Esses organismos são parasitas que alternam entre hospedeiro invertebrado e vertebrado, onde são capazes de sobreviver e replicar nos macrófagos. Uma das condições críticas encontrada pela Leishmania no macrófago é a carência de nutrientes, entre estes o ferro, que é fundamental como cofator para diversas enzimas essenciais ao parasita. A identificação e estudo de genes essenciais para a tomada de ferro por esses parasitas revelaram que a disponibilidade de ferro tem um papel central na infectividade. Estes estudos também demonstraram que privação de ferro induz a expressão de uma série de genes cuja função ainda é desconhecida gerando uma excelente oportunidade para a identificação de componentes adicionais da maquinaria molecular envolvida no metabolismo de ferro desses parasitas. Os tripanossomatídeos possuem organelas únicas chamadas glicossomos, que representam uma das principais diferenças entre parasita e hospedeiro. Os glicossomos compartimentalizam enzimas envolvidas na via glicolítica, na -oxidação de ácidos graxos, e também participam em processos celulares antioxidantes. As superóxido dismutases dependentes de ferro (FeSOD) são enzimas particularmente importantes pelo papel na proteção do parasita contra radicais livres resultantes da ativação da NADPH oxidase, e os glicossomos de Leishmania compartimentalizam as isoformas B das superóxido dismutases (SODB1/2) que utilizam exclusivamente o ferro como cofator. Diversas tentativas frustradas de gerar nocautes de FeSODB mostraram que essa isoforma é essencial para a sobrevivência de Leishmania indicando que o transporte de ferro para o glicossomo, não explorado até o momento, também é um alvo interessante para identificação e estudo. Portanto, o objetivo desse trabalho é identificar e iniciar a caracterização de genes potencialmente envolvidos no transporte de ferro para o glicossomo de Leishmania. A partir da análise in silico de 576 transcritos de L. amazonensis significativamente modulados pela privação de ferro, buscamos os genes que continham domínios transmembrana e sinais de endereçamento para os glicossomos (PTS1 e/ou PTS2) preditos. Dentre 11 genes encontrados, começamos a caracterização dos 5 que possuem 3 ou mais domínios transmembrana preditos, são eles: LmxM.04.1030, LmxM.14.0540, LmxM.22.0580, LmxM.24.1090 e LmxM.30.0020. Para isso, clonamos as ORFs desses 5 genes nos vetores de expressão de Leishmania pXG-GFP+ e pXG-GFP2+, para fusão dos genes alvo à sequência codificadora da proteína fluorescente EGFP. As construções obtidas foram transfectadas em promastigotas de L. amazonensis. Selecionamos diversos clones e confirmamos a superexpressão dos genes alvo por qPCR. Avaliamos a localização das proteínas alvo fundidas a EGFP em ensaios de imunofluorescência e com isso mostramos a colocalização das proteínas codificadas por LmxM.24.1090 e LmxM.30.0020 fundidas a EGFP com a proteína glicossomal arginase. Realizamos ensaios para avaliar a replicação in vitro de promastigotas superexpressores selecionados, e os resultados obtidos indicam que as linhagens superexpressoras de LmxM.04.1030, LmxM.14.0540, LmxM.22.0580, LmxM.24.1090 e LmxM.30.0020 crescem mais lentamente que a linhagem selvagem. Além disso, investigamos se a superexpressão dos genes alvo modula diferencialmente a expressão de genes previamente relacionados ao transporte e metabolismo de ferro, e à outras vias metabólicas glicossomais. Nossos resultados revelaram a indução da expressão gênica de arginase e do transportador de arginina AAP3 5.1 nas linhagens superexpressoras de LmxM.14.0540, LmxM.22.0580, LmxM.24.1090 e LmxM.30.0020. Assim, nossos resultados indicam que os genes LmxM.24.1090 e LmxM.30.0020 estão potencialmente envolvidos no metabolismo de ferro glicossomal. A construção e caracterização de parasitas nocaute destes genes permitirá caracterizar suas funções moleculares contribuindo na elucidação dos mecanismos envolvidos no transporte e metabolismo de ferro no glicossomo de Leishmania.

Protozoa of the genus Leishmania are the etiological agents responsible for the diseases known as leishmaniasis that affect millions of people worldwide. These organisms are parasites that alternate between the invertebrate and vertebrate host where they are able to survive and replicate in macrophages. One of the critical conditions found by Leishmania in the macrophage is the lack of nutrients, including iron, which is fundamental as a cofactor for several enzymes essential to the parasite. The identification and study of genes essential for iron uptake by these parasites revealed that iron availability plays a central role in infectivity. These studies also demonstrated that iron deprivation induces the expression of a series of genes whose function is still unknown, providing an excellent opportunity for the identification of additional components of the molecular machinery involved in the iron metabolism of these parasites. Trypanosomatids have unique organelles called glycosomes, which represent one of the main differences between parasite and host. Glycosomes compartmentalize enzymes involved in the glycolytic pathway, in the -oxidation of fatty acids, and also participate in cellular antioxidant processes. Iron-dependent superoxide dismutases (FeSOD) are particularly important enzymes due to their role in protecting the parasite against free radicals resulting from NADPH oxidase activation, and Leishmania glycosomes compartmentalize the B isoforms of superoxide dismutases (SODB1/2) that use exclusively iron as a cofactor. Several failed attempts to generate FeSODB knockouts showed that this isoform is essential for the survival of Leishmania, indicating that the transport of iron to the glycosome, not explored so far, is also an interesting target for identification and study. Therefore, the objective of this work is to identify and begin the characterization of genes potentially involved in iron transport to the Leishmania glycosome. From the in silico analysis of 576 L. amazonensis transcripts significantly modulated by iron deprivation, we searched for genes that contained predicted transmembrane domains and glycosomal targeting signals (PTS1 and/or PTS2). Among 11 genes found, we started the characterization of the 5 that have 3 or more predicted transmembrane domains, they are: LmxM.04.1030, LmxM.14.0540, LmxM.22.0580, LmxM.24.1090 and LmxM.30.0020. For this, we cloned the ORFs of these 5 genes in the Leishmania expression vectors pXG-GFP+ and pXG-GFP2+, for fusion of the target genes to the coding sequence of the fluorescent protein EGFP. The obtained constructs were transfected into L. amazonensis promastigotes. We selected several clones and confirmed the overexpression of target genes by qPCR. We evaluated the localization of the target proteins fused to EGFP in immunofluorescence assays and with that we showed the colocalization of the proteins encoded by LmxM.24.1090 and LmxM.30.0020 fused to EGFP with the glycosomal arginase protein. We performed assays to evaluate the in vitro replication of selected overexpressing promastigotes, and our results indicate that the lines overexpressing LmxM.04.1030, LmxM.14.0540, LmxM.22.0580, LmxM.24.1090 and LmxM.30.0020 grow slower than the wild type. Furthermore, we investigated whether the overexpression of target genes differentially modulates the expression of genes previously related to iron transport and metabolism, and to other glycosomal metabolic pathways. Our results revealed the gene expression induction of arginase and arginine transporter AAP3 5.1 in the overexpressing strains of LmxM.14.0540, LmxM.22.0580, LmxM.24.1090 and LmxM.30.0020. Thus, our results indicate that the genes LmxM.24.1090 and LmxM.30.0020 are potentially involved in glycosomal iron metabolism. The construction and characterization of knockout parasites of these genes will allow the characterization of their molecular functions, contributing to the elucidation of the mechanisms involved in the transport and metabolism of iron in the Leishmania glycosome.