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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.41.2010.tde-21072010-135930
Documento
Autor
Nome completo
Maria Fernanda Laranjeira da Silva
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2010
Orientador
Banca examinadora
Winter, Lucile Maria Floeter (Presidente)
Cruz, Angela Kaysel
Markus, Regina Pekelmann
Sabbaga, Maria Carolina Quartim Barbosa Elias
Thiemann, Otavio Henrique
Título em português
Relação entre a localização celular da enzima arginase de Leishmania (Leishmania) amazonensis e seu papel na infecção de macrófagos murinos
Palavras-chave em português
Arginase
Glicossomo
Infecção
Resumo em português
Nos hospedeiros mamíferos, os parasitas do gênero Leishmania vivem nos macrófagos se evadindo de mecanismos microbicidas dessas células, tais como a produção de óxido nítrico (NO). A produção de NO pela enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) nos macrófagos requer L-arginina como substrato, o mesmo aminoácido utilizado pela arginase para produzir ornitina e uréia. Logo, a arginase pode atuar na sobrevivência de Leishmania no hospedeiro competindo com a iNOS, reduzindo a produção de NO, além de seu papel na via de poliaminas, essencial para a replicação dessas células. Com isso, o objetivo desse estudo é elucidar o papel da arginase de L. (L.) amazonensis durante o ciclo de vida do parasita, particularmente, sua função no estabelecimento e na manutenção da infecção da célula hospedeira, e como esse papel seria exercido. Nesse sentido, obtivemos soros policlonais anti-arginase, a partir da arginase recombinante de L. (L.) amazonensis purificada, e esses soros foram utilizados na imunomarcação da enzima em preparações com formas promastigotas e macrófagos infectados com amastigotas de L. (L.) amazonensis. Assim, determinamos a compartimentalização da arginase nos glicossomos tanto na forma promastigota do parasita como na forma amastigota, durante a infecção. Além disso, obtivemos diversos mutantes com a expressão de arginase modificada quanto à quantidade e localização que nos permitiram avaliar a importância da compartimentalização dessa enzima nos glicossomos. Entre esses mutantes temos: superexpressores de arginase, com e sem sinal de endereçamento para glicossomo; parasitas com um alelo de arginase nocauteado e o outro substituído pelo cassete contendo o segmento ddFKBP-ARG, que teriam a expressão de arginase regulada pelo domínio ddFKB sendo nocautes funcionais de arginase; e finalmente, também obtivemos parasitas nocaute nulo de arginase. A análise desses mutantes permitiu conclusões importantes para o conhecimento da fisiologia do parasita e sua relação com o macrófago, revelando que o papel da arginase de Leishmania parece ser muito mais complexo do que o inicialmente postulado, participando na regulação de outras vias metabólicas do próprio parasita e da célula hospedeira. Paralelamente, também determinamos que o sistema ddFKBP é funcional em L. (L.) amazonensis, e assim pode ser utilizado no estudo funcional de outras proteínas importantes para esses parasitas.
Título em inglês
The relationship between the cellular location of Leishmania (Leishmania) amazonensis arginase and its role during murine macrophage infection
Palavras-chave em inglês
Arginase
Glycosome
Infection
Resumo em inglês
In the mammal host, Leishmania parasites live inside macrophages escaping from their microbicidal mechanisms, such as the nitric oxide (NO) production. The macrophage NO production by inducible nitric oxide synthase (iNOS) requires L-arginine as substrate, the same amino acid required by arginase to generate ornithine and urea. So, arginase may play a dual role in Leishmania survival reducing the NO by competing with iNOS, and participating in the polyamines pathway, which is essential for the cells replication. Considering this, the aim of this study is to elucidate the role of L. (L.) amazonensis arginase during the parasite life cycle, mainly its function for the establishment and maintenance of the host cell infection, besides to elucidate the way that this enzyme plays its role. With this in mind, we obtained polyclonal anti-arginase sera using purified recombinant L. (L.) amazonensis arginase, these sera were used in immunolabelling assays of L. (L.) amazonensis promastigotes and macrophages infected with L. (L.) amazonensis amastigotes. These experiments determined that arginase is compartmentalized in the glycosomes of both promastigotes and amastigotes, during infection. Besides, we obtained several mutants with altered arginase expression, modified in terms of quantity and location, which permitted us to evaluate the importance of glycosome arginase compartmentalization. Among these mutants are: overexpressors of arginase, with and without glycosomal addressing signal; parasites with one arginase allele knocked out and the other one replaced by a sequence containing the ddFKBP-ARG fusion that would allow us to regulate arginase expression, working like a functional arginase knockout; and finally, we also obtained arginase null knockouts parasites. The mutants analyses lead us to important conclusions for the knowledge of the parasite physiology and its relationship with the host macrophage, revealing that the Leishmania arginase role appears to be more complex than previously thought, playing an important role in the regulation of other metabolic pathways, of the own parasite and of the host cell. In the other hand, we also determined that the ddFKBP system is functional in L. (L.) amazonensis, and then can be used for functional studies of other important parasite´s proteins.
 
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Tese_versaoParcial.pdf (932.65 Kbytes)
Data de Publicação
2010-08-18
 
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  • CASTILHO-MARTINS, EA, et al. Axenic Leishmania amazonensis Promastigotes Sense both the External and Internal Arginine Pool Distinctly Regulating the Two Transporter-Coding Genes [doi:10.1371/journal.pone.0027818]. PLoS ONE [online], 2011, vol. 6, n. 11, p. e27818.
  • DA SILVA, EA, et al. Biochemical and biophysical properties of a highly active recombinant arginase from Leishmania (Leishmania) amazonensis and subcellular localization of native enzyme [doi:10.1016/j.molbiopara.2008.02.011]. Molecular and Biochemical Parasitology [online], 2008, vol. 159, n. 2, p. 104-111.
  • DA SILVA, MFL, et al. Leishmania amazonensis Arginase Compartmentalization in the Glycosome Is Important for Parasite Infectivity [doi:10.1371/journal.pone.0034022]. PLoS ONE [online], 2012, vol. 7, n. 3, p. e34022.
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