Pistas ambientais, como a temperatura, podem gerar mudanças em processos fisiológicos de crustáceos, como por exemplo o ciclo de muda. O processo de muda é um evento cíclico subdividido em 5 principais estágios e cada um deles apresenta características distintas que levam a respostas fisiológicas específicas durante este ciclo. Esse processo é regulado majoritariamente por hormônios produzidos no complexo neuroendócrino, órgão-X/ glândula do seio, localizado no pedúnculo óptico, e no órgão-Y, localizado no cefalotórax. O hepatopâncreas por ser o principal órgão metabólico e apresentar alterações ao longo do ciclo de muda apresenta-se como um alvo importante do ciclo de muda. Diante da importância do ciclo de muda de crustáceos e sua possível modulação em resposta a temperatura, objetivamos investigar mecanismos regulatórios nos estágios de intermuda e pré-muda do Callinectes sapidus (siri azul) frente a estímulos térmicos abaixo e acima da condição termoestável. Neste contexto, a morfologia do hepatopâncreas, a concentração de ecdisteroides, colesterol e triglicerídeos circulantes na hemolinfa, a expressão de genes-chave e a proteogenômica da espécie foram analisadas. Mudanças mais acentuadas sobre o hepatopâncreas foram vistas nos espécimes em pré-muda entre as temperaturas, embora na intermuda também ocorram, mas de maneira mais sutil. Os níveis de ecdisteroides foram consideravelmente reduzidos quando os animais em pré-muda foram submetidos ao frio. Dentre os metabólitos o colesterol apresentou diferença entre os estágios e na pré-muda sua concentração foi afetada pela temperatura, já nos triglicérides a condição térmica mais alta distinguiu significativamente entre os estágios. A expressão das proteínas de choque térmico (HSPs) foram alteradas principalmente no hepatopâncreas e se mostraram dependentes da temperatura e do estágio de muda. A alta expressão das HSPs no órgão-Y ocorreram quando os animais de pré-muda foram submetidos ao frio. Os receptores de ecdisteroides no pedúnculo óptico estavam mais expressos na intermuda comparando-se com a pré-muda e a temperatura parece não acometer essa resposta, ao contrário de sua expressão no hepatopâncreas que foi significativamente maior quando os animais de pré-muda foram estimulados pelo frio. A síntese do hormônio inibidor da muda (MIH) parece ser constitutiva, já que os diferentes estágios e as temperaturas não causaram mudanças; no entanto, seu receptor no órgão-Y sofreu redução na expressão gênica em animais em pré-muda submetidos ao frio, sendo menor também em comparação aos espécimes de intermuda na mesma condição. O hormônio hiperglicemiante de crustáceos (CHH) apresentou um aumento na sua expressão quando os animais de intermuda foram submetidos a temperatura acima da condição controle, tanto entre as outras temperaturas no mesmo estágio, quanto a mesma temperatura no outro estágio, a pré-muda. A proteogenômica nos possibilitou correlacionar os dados até então obtidos com o conteúdo proteico do pedúnculo óptico, o que revelou diferenças na abundância de proteínas majoritárias entre os estágios avaliados, sendo a homeostase energética celular e o processo de alteração estrutural da cutícula associados a pré-muda e intermuda, respectivamente. Um fenótipo de intermuda em animais de pré-muda submetidos ao frio foi constatado tanto nos níveis circulantes de ecdisteroides quanto na análise de agrupamento entre os estágios de muda sob as 3 temperaturas. Quanto às proteínas de choque térmico, estas apresentaram-se reduzidas nos animais de pré-muda submetidos ao frio. Em definitivo, os hormônios peptídicos MIH e CHH estavam reduzidos na intermuda em comparação a pré-muda sugerindo uma liberação destes pela glândula do seio. Nossos resultados demonstraram que a temperatura é um modulador efetivo das respostas relacionadas ao ciclo de muda em vários níveis, e que a temperatura abaixo da condição controle causou um maior efeito sobre as respostas avaliadas em relação a condição termoestável, principalmente quando o animal se encontra no estágio de pré-muda.

Environmental cues can generate changes in physiological processes of crustaceans, such as the molting cycle. The molting process is a cyclic event subdivided into 5 main stages and each of them presents distinct characteristics that lead to specific physiological responses during this cycle. This process is mainly regulated by hormones produced in the neuroendocrine complex, the X-organ / sinus gland, located in the eyestalk, and the Y-organ, located in the cephalothorax. The hepatopancreas, being the main metabolic organ and presenting changes throughout the molting cycle, presents itself as an important target of the molting cycle. Given the importance of the crustacean molting cycle and its possible modulation in response to temperature, we aimed to investigate regulatory mechanisms in the intermolt and pre-molt stages of Callinectes sapidus (blue crab) facing thermal stimuli below and above the thermo-neutral condition. In this context, the morphology of the hepatopancreas, the concentration of ecdysteroids, cholesterol and circulating triglycerides in the hemolymph, the expression of key genes, and the proteogenomics of the species were analyzed. More pronounced changes in the hepatopancreas were seen in premolt specimens between temperatures, although they also occur in intermolt, but more subtly. Ecdysteroid levels were considerably reduced when premolt animals were subjected to cold. Among metabolites, cholesterol showed a difference between stages and its concentration was affected by temperature in premolt animals, while triglycerides were distiguished between stage at the the highest thermal condition. The expression of heat shock proteins (HSPs) was mainly altered in the hepatopancreas and showed to be dependent on temperature and molt stage. High expression of HSPs in the Y-organ occurred when premolt animals were subjected to cold. Ecdysteroid receptors in the eyestalk were more expressed in intermolt compared to premolt and temperature does not seem to affect this response. Unlikely its expression in the hepatopancreas was significantly higher when premolt animals were stimulated by cold. The synthesis of molt inhibiting hormone (MIH) appears to be constitutive, since different stages and temperatures did not cause changes; however, its receptor in the Y-organ underwent a reduction in gene expression in pre-molt animals subjected to cold, being also lower compared to intermolt specimens under the same condition. The crustacean hyperglycemic hormone (CHH) showed an increase in its expression when intermolt animals were subjected to a temperature above control condition, either between tenperatures at the same stage or at the same temperature in another stage, premolt. Proteogenomics allowed us to correlate data obtained so far with protein content of eyestalk which revealed differences in the abundance of major proteins between the evaluated stages: cellular energy homeostasis and cuticle structural alteration processes associated with premolt and intermolt respectively. An intermolt phenotype was observed in both the circulating ecdysteroid levels and the cluster analysis between molt stages under 3 temperatures. As for heat shock proteins, they were reduced in pre-molt animals subjected to cold. Definitively, the peptide hormones MIH and CHH proved to be reduced during intermolt compared to premolt stages suggesting increased release by the sinus gland. Our results demonstrated that temperature is an effective modulator of responses related to the molting cycle at various levels, and that temperature below the control condition caused a greater effect on the evaluated responses in relation to the thermo-stable condition, especially when the animal is in the pre-molt stage.