Mecanismos epigenéticos em hepatoblastomas: análise do transcriptoma e sua regulação por metilação de DNA. Tumores hepáticos em crianças são raros, representando 1 - 4% de todos os tumores sólidos pediátricos, sendo o hepatoblastoma o mais frequente. Hepatoblastomas são tumores embrionários, com idade muito precoce de manifestação e apresentação histológica característica, que recapitula diferentes fases da organogênese do fígado. Em decorrência de sua raridade, os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e progressão deste tipo tumoral ainda são pouco explorados e praticamente inexistem biomarcadores para estratificação de risco. Apresentando a menor taxa de mutação somática dentre os tumores sólidos, o hepatoblastoma é um câncer que ainda tem sua origem e mecanismos moleculares debatidos na literatura científica. Há reconhecido link entre epigenética, desenvolvimento fetal e tumores pediátricos e, nos últimos anos, o estudo com foco na epigenética de hepatoblastomas ganhou maior importância como um mecanismo chave. Este estudo teve como objetivo central a avaliação do papel da metilação de DNA na alteração do padrão de expressão gênica de hepatoblastomas. Foram avaliadas no total um conjunto de 30 amostras de hepatoblastomas e 11 amostras de tecido hepático não tumoral, derivadas de colaboração com três centros de câncer infantil da cidade de São Paulo (AC Camargo Cancer Center, GRAAC e ITACI). Também foram utilizadas linhagens celulares de tumores hepáticos e células pluripotentes induzidas (IPSCs) diferenciadas em hepatoblastos e hepatócitos-like. Utilizando técnicas como qRT-PCR, western blot, imunohistoquímica, metabolômica, RNASeq e nível global de hidroximetilação, os objetivos foram (a) identificar o mecanismo de hipometilação de DNA em hepatoblastomas e determinar o nível de 5-hidroximetilcitosina; (b) caracterizar as amostras de hepatoblastoma de acordo com as etapas de diferenciação celular de hepatócitos; (c) avaliar o impacto de alterações de metilação previamente identificadas no transcriptoma tumoral (genes codificadores e não codificadores). Estudamos o padrão de expressão de genes da maquinaria de metilação de DNA (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, DNMT3L, UHRF1, TET1, TET2 e TET3) nestes tumores e o nível global de 5hmC. Detectamos elevada expressão dos genes da maquinaria epigenética, principalmente UHRF1, TET1 e TET2, em associação com enriquecimento do conteúdo de 5hmC. Estes resultados indicam a ocorrência em hepatoblastomas de desmetilação ativa do DNA, mediada por TETs, provavelmente durante os estágios iniciais do desenvolvimento do fígado. Além disso, níveis mais baixos de 5hmC em hepatoblastomas podem estar associados à redução da sobrevida global. Em seguida, avaliamos a utilização do padrão de expressão de genes da maquinaria epigenética e de diferenciação hepática como elementos-chave para a estratificação de hepatoblastomas. Foi possível a estratificação das amostras tumorais em três grupos, destacando a importância de 13 genes (TET1, TET2, TET3, DNMT1, DNMT3A, UHRF1, ALB, CYP3A4, TDO2, UGT1A1, AFP, HNF4A e FOXA2) para o estabelecimento desta classificação. Os resultados permitiram correlacionar os grupos identificados com distintos níveis de metilação global de DNA, que estão de acordo com a fase de diferenciação hepática em que as células tumorais se encontrariam, o que corrobora a hipótese de bloqueio de diferenciação do órgão de origem. Deste modo, propusemos assinaturas tumorais associadas a diferentes fases de diferenciação hepática com base em expressão gênica e em nível de metilação de DNA. Evidenciamos redução significativa de expressão gênica e proteica de NNMT em hepatoblastomas. Níveis mais elevados de NNMT foram estatisticamente associados ao diagnóstico tardio em hepatoblastoma, uma reconhecida variável clínica de pior prognóstico. A análise metabolômica não direcionada detectou metabolismo lipídico aberrante em hepatoblastomas, sugerindo que a diminuição de NNMT pode estar associada à redução detectada do conteúdo lipídico em amostras de hepatoblastoma, possivelmente relacionada a concentrações alteradas de metabólicos ligados a função do NNMT ou precursores de NAD+. Os dados apresentados aqui mostraram pela primeira vez que a redução de NNMT ocorre em hepatoblastomas, fornecendo apoio adicional à teoria de que sua regulação negativa é um fenômeno geral em câncer de fígado. Com o objetivo de compreender melhor os processos biológicos alterados, realizamos análises de bioinformática a partir de dados de RNASeq de hepatoblastomas e amostras de fígado normais. Foi identificado um grupo de 1492 genes com expressão diferencial entre tumores e amostras controle (Differentially Expressed Genes - DEGs), 1.031 deles regulados positivamente e 461 com diminuição de expressão. A lista de DEGs contém genes codificadores de proteínas e ncRNAs, estes principalmente regulados positivamente. Oitenta e cinco dos genes com expressão diferencial são expressos exclusivamente em amostras tumorais, sendo aproximadamente 55% deles ncRNAs. Dentre os 50 principais genes, aqui definidos como aqueles com a maior alteração de expressão, 42% correspondem a ncRNAs; três (MAGED4, SNO144-16 e RP11-431J24.2) com expressão detectável exclusivamente em tumores. Adicionalmente, 16 destes genes com maior diferença de expressão entre tumores e fígado normal já haviam sido identificados anteriormente como alterados neste grupo tumoral (GCK, HMGA2, INS-IGF2, DKK1, CPA6, TTC36, LIX1, PART1, DKK4, CDCA7, GNG4, THRSP, CNDP1, CYP2B7P, ASPG e HAO2). Os processos biológicos foram enriquecidos em regulação negativa do metabolismo, principalmente de amina, nicotinamida e lipídios / ácidos graxos; também há alteração de mecanismos epigenéticos, como metilação do DNA, ncRNAs e silenciamento de genes por miRNA; citotoxicidade e vias de sinalização, incluindo mediada por citocinas. Uma rede de interação miRNA-mRNA foi construída, identificando quatro genes (miR-186, miR-214, miR-377 e miR-494), cada um deles conectado a mais de 10 mRNAs. Os principais processos biológicos relacionados a esta rede miRNA-mRNA foram associados também a metabolismo e reações de oxidação de lipídios e carboidratos. Em conclusão, a análise de RNASeq evidenciou grande alteração de vias metabólicas em hepatoblastomas, incluindo lipídios, aminas e nicotinamidas, o que retoma resultados anteriores de nosso grupo. Também revelou grande modificação na rede de expressão de ncRNAs neste tipo de tumores. A detecção de processos biológicos alterados fornece pistas para o entendimento das vias de tumorigênese em hepatoblastomas e os achados de genes centrais indicam candidatos a futuras análises funcionais.

Epigenetic mechanisms in hepatoblastomas: transcriptome analysis and regulation by DNA methylation. Liver tumors in children are rare, representing 1 - 4% of all pediatric solid tumors, with hepatoblastoma being the most frequent. Hepatoblastoma is an embryonic tumor with a very early age of manifestation and characteristic histological presentation that recapitulates different phases of liver organogenesis. Due to its rarity, the molecular mechanisms underlying the development and progression of this tumor type are still poorly explored, and there are few biomarkers for risk stratification. With the lowest rate of somatic mutation among solid tumors, the origin and molecular mechanisms of hepatoblastoma are still discussed in the literature. There is a recognized link between epigenetics, fetal development, and pediatric tumors and, in recent years, the study focused on the epigenetics of hepatoblastomas has gained greater importance as a key mechanism. This study had as its central objective the evaluation of the role of DNA methylation in altering the pattern of gene expression of hepatoblastomas. A total of 30 samples of hepatoblastomas and 11 samples of non-tumor liver tissue were evaluated, derived from collaboration with three pediatric cancer centers in São Paulo (AC Camargo Cancer Center, GRAAC, and ITACI). Liver tumor cell lines and induced pluripotent cells (IPSCs) differentiated into hepatoblasts and hepatocytes-like were also used. Using techniques such as qRT-PCR, western blot, immunohistochemistry, metabolomics, RNASeq, and global level of hydroxymethylation, the objectives were (a) to identify the mechanism of DNA hypomethylation in hepatoblastomas and to determine the level of 5-hydroxymethylcytosine; (b) characterize the samples of hepatoblastoma according to the steps of cell differentiation from hepatocytes; (c) assess the impact of previously identified changes in the tumor methylome on the total transcriptome (coding and non-coding genes). We studied the gene expression pattern of DNA methylation machinery (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, DNMT3L, UHRF1, TET1, TET2, and TET3) in these tumors and investigated the overall level of 5hmC in hepatoblastoma. We detected high expression of epigenetic machinery genes, mainly UHRF1, TET1, and TET2, in association with enrichment of the content of 5hmC. These results indicate the occurrence of active DNA demethylation in hepatoblastomas, mediated by TETs, probably during the early stages of liver development. In addition, lower levels of 5hmC in hepatoblastomas may be associated with reduced overall survival. In addition, we evaluated the use of the gene expression pattern of epigenetic machinery and liver differentiation as pivotal elements for hepatoblastoma stratification. It was possible to stratify tumor samples into three groups, highlighting the importance of 13 (TET1, TET2, TET3, DNMT1, DNMT3A, UHRF1, ALB, CYP3A4, TDO2, UGT1A1, AFP, HNF4A, and FOXA2) genes for the establishment of this classification. The results made it possible to correlate the identified groups with different levels of global DNA methylation, which are in accordance with the phase of liver differentiation in which the tumor cells would meet, which corroborates the hypothesis of blocking the differentiation of the source organ. Thus, we proposed tumor signatures associated with different stages of liver differentiation based on gene expression and DNA methylation level. We evidenced a significant reduction in NNMT gene and protein expression in hepatoblastomas. The higher expression of NNMT was statistically associated with a late diagnosis of hepatoblastoma, a recognized clinical variable with a worse prognosis. The undirected metabolomic analysis detected aberrant lipid metabolism in hepatoblastoma, suggesting that the decrease in NNMT may be associated with the detected reduction in lipid content in tumor samples, possibly related to altered concentrations of metabolic linked to NNMT function or NAD+ 123 precursors. The data presented here showed for the first time that the reduction of NNMT occurs in hepatoblastomas, providing additional support for the theory that the negative regulation of this protein is a general phenomenon in liver cancer. To better understand the altered biological processes, we performed bioinformatics analyzes based on data from RNASeq of normal hepatoblastomas and liver. A group of 1492 genes with differential expression between tumors and control (Differentially Expressed Genes - DEGs) was identified, 1,031 of them regulated positively and 461 with decreased expression. A list of DEGs contains genes encoding proteins and ncRNAs, which are mainly upregulated. Eighty-five of the genes with differential expression are expressed exclusively in our tumors, with approximately 55% of them being ncRNAs. Among the 50 main genes, defined here as those with the greatest expression alteration, 42% correspond to ncRNAs; three (MAGED4, SNO144-16 and RP11-431J24.2) had detectable expression exclusively in tumors and, in addition, 16 of these genes with greater difference in expression between tumors and normal liver had previously been identified as altered in this tumor group (GCK, HMGA2, INS-IGF2, DKK1, CPA6, TTC36, LIX1, PART1, DKK4, CDCA7, GNG4, THRSP, CNDP1, CYP2B7P, ASPG and HAO2). The biological processes were enriched in the sense of negative regulation of metabolism, mainly of amine, nicotinamide and lipids/fatty acids; there is also a change in epigenetic mechanisms, such as DNA methylation, ncRNAs and gene silencing by miRNA; cytotoxicity and signaling pathways, including cytokine-mediated signaling pathway. A miRNA-mRNA interaction network was built, identifying four genes (miR-186, miR-214, miR-377 and miR-494) where each is connected to more than 10 mRNAs. The main biological processes related to this miRNA-mRNA network were also associated with metabolism and oxidation reactions of lipids and carbohydrates. In conclusion, the analysis of RNASeq showed great alteration of metabolic pathways in hepatoblastomas, including lipids, amines and nicotinamides, which resumes previous results of our group. It also revealed major changes in the ncRNA expression network in this type of tumor.