Nas últimas décadas, diversas terapias foram desenvolvidas e testadas para tratar a Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), no entanto nenhuma delas foi capaz de aumentar expressivamente a qualidade ou expectativa de vida dos pacientes, indicando a necessidade de novas abordagens terapêuticas. Além disso, o papel da via de sinalização do Notch, mais especificamente o Notch3, em controlar o pool de células satélite do músculo e outros progenitores miogênicos não foi totalmente elucidado. Aprofundar nossa compreensão sobre a via do Notch pode ser essencial para a criação de uma terapia capaz de transformar a vida dos pacientes. Neste estudo, CRISPR foi usado para corrigir geneticamente células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), derivadas da pele de dois meio-irmãos com curso clínico discordante, portadores de uma duplicação no exon 2 de DMD. Nosso objetivo era investigar a viabilidade de se gerar células satélite corrigidas geneticamente e capazes de se diferenciar em músculo que produz distrofina. Paralelamente, para estudar os efeitos da via do Notch na formação dos progenitores miogênicos in vitro, foram diferenciadas células não editadas e Notch3 knockout dos mesmos pacientes através de uma metodologia livre de transgenes. Os resultados mostram que é possível gerar células satélite e outros progenitores miogênicos in vitro corrigidos geneticamente para o gene DMD e capazes de produzir distrofina, de forma que estas células podem ser potencialmente utilizadas no desenvolvimento de uma nova terapia celular e gênica, reduzindo-se as chances de uma rejeição imunológica por se tratarem de células do próprio paciente. Contudo, uma possível resposta imunológica à proteína Distrofina introduzida ao músculo dos pacientes precisa ser investigada. Também foi observado que progenitores miogênicos com knockout em Notch3 possuem expressão gênica significativamente maior dos marcadores miogênicos Pax7, MyoD e MyoG e que estas células crescem notadamente mais que células não editadas, sugerindo que o Notch3 limita a população de células satélites quiescentes e ativadas, podendo agir como um inibidir de crescimento por contato. Este estudo propõe que ao manipular a expressão de Notch3 é possível alterar a composição dos progenitores miogênicos, o que pode ser vantajoso no desenvolvimento de uma terapia celular e gênica baseada nestas células.

Over the last decades, several therapies have been developed and tested to treat Duchenne Muscular Dystrophy (DMD), yet none of them had expressive improvement in life expectancy or quality of life for patients, indicating the need of new treatment approaches. Furthermore, the role of the Notch signaling pathway, more specifically Notch3, in controlling the pool of muscle satellite cells and other myogenic progenitors is not completely elucidated. Enhancing our comprehension on the Notch pathway might be essential for the development of a therapy that could be life changing for patients. In this study, CRISPR was used to genetically correct induced Pluripotent Stem Cell (iPSCs), derived from the skin of two half-brothers with a discordant clinical course, carrying an exon 2 duplication in DMD. Our aims were to investigate the viability of generating genetically corrected satellite cells capable of differentiating into muscle that produces dystrophin. In parallel, to study the effects of the Notch signaling pathway in the formation of myogenic progenitors in vitro, non-edited and Notch3 knockout cells from the same patients were differentiated with a transgene-free method. The results show that it is possible to generate satellite cells and other myogenic progenitors in vitro that are genetically corrected for DMD and capable of producing dystrophin. Therefore, these cells can be potentially used in the development of a new gene and cellular therapy, reducing the chances of immune rejection as patients own cells are used. However, a possible immune response to the Dystrophin protein introduced to patients muscle must be considered. It was also observed that Notch3 knockout myogenic progenitors express significantly more the myogenic markers Pax7, MyoD and MyoG and that these cells grow notably more than non-edited cells, which suggests that Notch3 limits the population of quiescent and activated satellite cells, possibly acting as an inhibitor of growth by contact. This study proposes that by manipulation Notch3 expression it is possible to alter myogenic progenitors composition, which may be advantageous in the development of a gene and cellular therapy based on these cells.